4-氨基-2-三氟甲基苯基维甲酸酯对人乳腺癌MCF-7细胞的诱导分化作用及其机制研究
全反式维甲酸(alltransretinoicacid,ATRA)作为诱导分化剂已广泛应用于急性早幼粒性细胞白血病的临床治疗,其能诱导肿瘤细胞逐渐向正常细胞分化从而达到治愈肿瘤的目的,但同时也存在维甲酸综合征和耐药等不足。本实验室以ATRA为先导化合物,通过对其碳链末端极性基团进行结构修饰,合成了一系列全新的维甲酸衍生物,经过体外药效学筛选发现4-氨基-2-三氟甲基苯基维甲酸酯(4-amino-2-trifluoromethyl-phenylretinate,ATPR)具有较强的抗肿瘤增殖和诱导分化活性,并已申请获得自主知识产权(专利公开号:CN101591280、CN102008443A),有望开发成为一种新型抗肿瘤药。本研究以人乳腺癌细胞株MCF-7为研究对象,体外观察了ATPR对乳腺癌细胞增殖及分化的影响,并探讨其作用的分子机制。 目的：本研究观察新型维甲酸衍生物4-氨基-2-三氟甲基苯基维甲酸酯(4-amino-2-trifluoromethyl-phenylretinate,ATPR)对人乳腺癌MCF-7细胞增殖和分化的作用,并探讨其作用的可能分子机制。 方法： 1.新型维甲酸类衍生物ATPR(终浓度分别为10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9mol/L)作用于人乳腺癌MCF-7细胞后,通过MTT法检测细胞增殖情况;细胞计数法绘制细胞生长曲线;瑞氏-吉姆萨染色法在倒置相差显微镜下观察加药处理前后细胞形态学变化;酶联免疫法检测乳腺癌细胞分化标志物粘蛋白(MUC-1)活性;流式细胞术测定细胞周期的变化。 2.选择MCF-7细胞为实验对象,设空白对照组(加入等体积的DMEM)、溶剂对照组(含0.05％无水乙醇)、阳性药对照组ATRA(浓度为10-5mol/L)及实验组ATPR(终浓度分别为10-5、10-6、10-7、10-8、10-9mol/L),采用RT-PCR技术检测ATPR用药72h后引起的细胞中维甲酸受体RARα,RARβ,RARγ、雌激素受体ERα,ERβ和维甲酸受体诱导基因1RRIG1mRNA表达的变化;采用WesternBlot技术检测ATPR用药72h后引起的细胞中维甲酸受体RARα,RARβ,RARγ蛋白的表达变化。 3.采用RNA干扰技术,体外观察siRNA序列靶向沉默MCF-7细胞RRIG1后6h加入ATPR(终浓度为10-5mol/L),对细胞内ERs和MAPK通路相关蛋白(ERK1/2、p38)的影响。探究RRIG1在介导ATPR作用于MCF-7细胞中的作用。 结果： 1.ATPR(10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9mol/L)体外用药可抑制乳腺癌细胞MCF-7的增殖,抑制作用于药物作用48h后出现,72h后达峰值。且随着剂量的增加,抑制效应增强。ATPR浓度为10-4mol/L时,药物对细胞增殖的抑制效率明显高于其他剂量组,且镜下观察发现MCF-7细胞出现皱缩、凋亡。瑞氏-吉姆萨染色结果显示ATPR(10-5、10-6、10-7、10-8、10-9mol/L)体外用药可诱导MCF-7细胞形态趋于成熟分化。与溶剂对照组比较,ATPR用药组MCF-7细胞上清中MUC-1含量下降,以药物浓度为10-5mol/L时MUC-1含量下降最为显著(P<0.01)。流式细胞术结果显示ATPR(10-5、10-6、10-7、10-8、10-9mol/L)用药后MCF-7细胞G0/G1期细胞表达量增加,S期减少,细胞周期进程受影响,细胞阻滞在G0/G1期。 2.ATPR(10-5、10-6、10-7、10-8、10-9mol/L)、ATRA(10-5mol/L)作用72h后,与溶剂对照组相比,MCF-7细胞中RARβ、ERβ、RRIG1mRNA表达量随ATPR浓度的升高而增加,以药物浓度10-5mol/L增加最显著(P<0.05);RARγmRNA表达量随ATPR浓度的升高而减少,同样以药物浓度10-5mol/L增加最显著(P<0.05);RARα、ERαmRNA表达量没有明显变化。Westernblot结果同样显示与溶剂对照组相比,ATPR(10-5mol/L)作用72h后,RARβ蛋白表达量增加(P<0.05),RARγ蛋白表达量降低(P<0.05),RARα蛋白表达量没有明显变化。 3.靶向沉默RRIG1基因6h后加入ATPR(10-5mol/L)作用72h,RT-PCR结果显示:siRNA+ATPR组与ATPR组相比,ERβmRNA表达量显著降低(P<0.05),ERαmRNA表达量没有明显变化。Westernblot结果显示:siRNA+ATPR组与ATPR组相比,p-ERK1/2蛋白表达量明显增高(P<0.05),p-p38蛋白表达量明显降低(P<0.05)。 结论： 1.4-氨基-2-三氟甲基苯基维甲酸酯ATPR(10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9mol/L)可抑制乳腺癌细胞MCF-7的增殖并诱导其分化程度增高。 2.ATPR抑制MCF-7细胞增殖并诱导其分化的机制可能与其调节维甲酸受体RARs和雌激素受体ERs平衡、上调RRIG1表达有关。 3.RRIG1基因对雌激素受体的调控作用可能通过调节MAPK信号转导通路相关基因表达实现。
乳腺癌;4-氨基-2-三氟甲基苯基维甲酸酯;MCF-7细胞;诱导分化作用;分子机制
安徽医科大学
硕士
药理学
陈飞虎;葛金芳
2013
中文
R737.9;R730.53
87
2014-01-22（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）