LTB4-BLT2通路对小鼠树突状细胞功能的影响
研究背景： 白三烯(leukotriene,LT)作为体内重要的炎性介质,早已被证实参与机体多种免疫相关疾病的发生发展过程。对白三烯的研究,早期集中于哮喘等呼吸系统慢性炎症性疾病。后来的研究证实,其他组织或器官的免疫疾病中也已证实,白三烯类脂类介质与其他组织或器官的免疫疾病关系密切,如变异性鼻炎、溃疡性结肠炎、肾小球肾炎、类风湿性关节炎等。因此,靶向白三烯类及其受体通路的新药研发为上述疾病的防治提供新方向。 白三烯来源于体内细胞膜磷脂成分的代谢过程。白三烯B4(Leukotriene B4,LTB4),化学名为5(S),12(R)-二羟基-6(E),8(E),10(E),14(E)-四烯二十烷酸,是强的脂类致炎因子和趋化因子,对多种细胞,如中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和单核细胞等均有强烈的趋化和致炎作用。多项研究证实了LTB4参与体内炎症有关疾病的进程。目前,LTB4受体已有两种亚型先后被发现,它们同属于G蛋白偶联受体(G protein coupled receptor),分别命名为BLT1与BLT2[1-2]。它们各自不同的分布表达特点提示,二者可能介导不同的功能。BLT1发现较早,多种与免疫有关疾病如川崎病、慢性阻塞性肺病、哮喘等与LTB4-BLT1通路的作用机制关系研究均较为深入,而对另一受体——BLT2的研究则相对缓慢。 作为机体免疫系统最主要的专职抗原提呈细胞(antigen presenting cells,APC),树突状细胞(dendritic cells,DCs)一直是免疫及有关疾病的研究热点。DCs的主要功能包括:①摄取、加工和呈递抗原;②选择性趋化;③激活初始T细胞(naiveTcells)[3-4]。研究发现,在膀胱癌、胃癌、结肠癌、关节炎、过敏性鼻炎等炎症有关的疾病的病理分析中,均存在明显的DCs浸润[5-8]。正常组织中DCs含量极少,大约占所有免疫细胞的0.5％-1%。研究表明,DCs表达BLT2且表达量伴随着细胞成熟过程而上调[9],提示LTB4-BLT2通路可能与DCs的免疫作用机制相关。为进一步探究二者的关系,本课题利用原代培养技术诱导制备足量DCs,通过RNA干扰阻断DCs中BLT2的表达,分析其趋化功能与细胞因子分泌及表达功能的改变情况,初步揭示了二者之间互相作用的机制。为接下来进一步探究其二者在免疫性疾病中发挥的作用提供理论依据。 方法： 1.DCs的诱导制备及检定:分离原代并培养小鼠骨髓来源单个核细胞,利用小鼠重组粒细胞集落刺激因子(Granulocyte Macrophage Colony Stimulating Factor,GM-CSF)及白细胞介素4(Interleukin 4,IL-4)诱导分化;细菌脂多糖(Lipopolysaccharides,LPS)刺激为成熟DCs。通过形态学观察初步判定细胞状态与数量,利用流式细胞术检测细胞表面因子CD11c、CD86、MHC-Ⅱ的表达情况,以检定DCs。 2.通过RT-PCR方法确认小鼠DCsBLT2的表达。 3.利用RNA干扰技术阻断LTB4-BLT2通路。确定转染效率后,利用不同浓度外源性LTB4刺激阻断通路的细胞,利用Transwell趋化小室结合MTT法共同评价DCs趋化功能。 4.RT-PCR检测小鼠DCs中TNF-α、IL-1β的表达。 5.LTB4刺激包括BLT2阻断或不阻断条件下的上述DCs,通过酶联免疫法测定细胞培养上清中TNF-α、IL-1β的量。 结果： 1.经过7天的诱导培养,小鼠骨髓细胞分离出的PBMC获得1×106个左右的DCs。随着培养时间的延长,细胞出现明显的毛刺状突起,小部分聚团的现象。流式细胞术结果显示,成熟的DCs表面高表达CD11c、CD86、MHC-Ⅱ细胞因子,未成熟细胞表达量稍低。 2.小鼠DCs高表达BLT2,优化siRNA转染条件,在基因水平与蛋白水平均可明显抑制BLT2的表达,从而阻断LTB4-BLT2通路。 3.趋化功能检测显示,LTB4能明显增强正常DCs的趋化能力,siRNA阻断BLT2基因表达的DCs,这种趋化能力明显被抑制。Transwell结合MTT数据证实,三种浓度LTB4均能明显增强对照转染组DCs趋化作用。与空白组相比,低、中、高三组增长率依次为27.8%、48.4%、71.5%。siRNA阻断BLT2通路后,LTB4对增强细胞趋化作用明显被抑制,阻断组与阴性对照相比,低、中、高和空白四组抑制率分别为59.5%、58.8%、66%、41.2%。 4.DCs表达TNF-α与IL-1β。以siRNA阻断BLT2通路表达,可明显下调二者mRNA表达水平。 5.ELISA结果证实,LTB4可刺激正常DCs分泌TNF-α和IL-1β,且分泌量与LTB4浓度成正比。siRNA抑制BLT2表达,可明显抑制LTB4对DCs两种细胞因子的刺激作用。 结论： 1)小鼠成熟DCs表达BLT2。2)LTB4明显刺激DCs表达并分泌TNF-α和IL-1β,siRNA阻断BLT2的表达则抑制LTB4的上述作用。3)同样地,其BLT2通路明显介入其趋化,同时,DCs分泌细胞因子的功能也与LTB4-BLT2通路相关。抑制BLT2基因表达,DCs的趋化移行作用受到抑制,4)BLT2参与DCs的免疫调节功能过程,为靶向BLT2新药的发现提供了实验论据。
白三烯B4;树突状细胞;原代培养技术;趋化功能;免疫性疾病
安徽医科大学
硕士
药理学
刘永学
2013
中文
R593;R392.12
72
2014-01-22（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）