斑点叉尾鮰(Ictalurus punctatus)hepcidin抗菌肽的基因工程制备
我国为世界水产大国,也是世界上唯一水产养殖产量高于捕捞产量的国家。然而,亟待解决的种质、病害与环境等关键问题日趋严重。由于细菌性感染和细菌性疾病呈上升趋势,为解决这些问题导致大量抗生素的使用,不仅破坏水产养殖动物体内的正常菌落,而且抗生素易在动物体内残留。基因工程抗菌肽替代传统抗生素或作为环保型饵料添加剂,既可以增强水产养殖生物的抗病能力,又可以提高养殖水产品的质量。 抗菌肽(Anti-bacterial peptides,简称ABP)是在诱导的条件下,动物免疫防御系统产生的一类对抗外源性病原体致病作用的防御性肽类活性物质,是动物免疫防御系统的一个重要组成部分。抗菌肽具有广谱抗菌活性,同时还具有高效的抗真菌、抗病毒和抗肿瘤活性。因此,抗菌肽类物质在医药和农业上有广阔的应用前景。本研究涉及到的肝脏表达的抗菌肽hepcidin,最初是从人的血液中分离得到。目前已有的报道证明 hepcidin对革兰氏阳性及阴性细菌均表现出抗菌活性,因此可以推测 hepcidin可作为一种替代抗菌肽的绿色饲料添加剂在水产养殖中应用。本研究选取斑点叉尾鮰为研究对象,采用重组DNA技术来制备抗菌肽。 本研究内容主要分为五部分,第一部分主要是斑点叉尾鮰hepcidin原前体肽及成熟肽基因的cDNA克隆。从斑点叉尾鮰的肝脏中提取总RNA,根据已知的斑点叉尾鮰 hepcidin基因序列设计引物,以第一股cDNA为模板,利用RT-PCR技术扩增得到长度为291bp的hepcidin全长基因,再以hepcidin全长基因为模板,利用巢式PCR技术分别扩增得到长度为219bp的hepcidin原前体肽基因和长度为78bp的hepcidin成熟肽基因,并进行了序列测定。Hepcidin全长基因编码96个氨基酸残基组成的多肽;经信号肽预测分析,该多肽的信号肽由24个氨基酸残基组成,成熟肽由25个氨基酸残基组成。斑点叉尾鮰与其他生物之间 hepcidin氨基酸序列的比对结果表明:斑点叉尾鮰与其他鱼类hepcidin之间氨基酸序列有较高的同源性,与哺乳动物之间显示了低的同源性,但是无论是鱼类还是哺乳动物都显示出位于多肽羧基端的8个半胱氨酸残基的高度保守,这与hepcidin抗菌活性密切相关。 第二部分主要是 hepcidin原前体肽基因和成熟肽基因的表达载体构建。以割胶纯化后的原前体肽基因和成熟肽基因分别作为模板,设计含EcoR I和Hind III酶切位点的引物,分别扩增得到长度为236bp的原前体肽基因pCH和长度为95bp的成熟肽基因mCH,将pCH、mCH和表达载体pET32a分别双酶切,利用DNA重组技术,在T4DNA连接酶的作用下,将pCH和mCH分别与表达载体pET32a连接。经过菌落 PCR检验、双酶切鉴定及序列测定证实:成功构建了 pET32a-pCH和pET32a-mCH重组表达质粒。 第三部分主要是pCH和mCH在大肠杆菌中的融合表达及表达产物的纯化。将重组表达质粒pET32a-pCH和pET32a-mCH分别转化宿主工程菌E.coli BL21(DE3),采用25℃,终浓度为1mmol/L的IPTG诱导融合蛋白表达。Tricine-SDS-PAGE分析结果表明:融合蛋白TrxA-pCH和TrxA-mCH得到了大量的表达。为了进一步获得高纯度的融合蛋白,利用IMAC即Ni-IDA琼脂糖凝胶柱的亲和作用对超声破碎后的总蛋白液进行层析,利用梯度的咪唑进行洗脱,通过Tricine-SDS-PAGE分析证明得到高纯度的TrxA-pCH和TrxA-mCH融合蛋白,其对应的分子量分别为33kD和26kD,与推断的分子量相符。将得到的高浓度 TrxA-mCH融合蛋白进行肠激酶酶切处理。酶切后的酶切混合物再经过超滤离心分离浓缩经Tricine-SDS-PAGE分析后将含有目的蛋白mCH的凝胶进行MALDI-TOF-TOF分析,分析结果证明获得了高纯度的目的蛋白mCH。 第四部分主要是 mCH成熟肽的抑菌活性鉴定。抑菌活性鉴定采用琼脂糖弥散法,以50μ g/mL氨苄青霉素为阳性对照,以无菌的ddH2O为空白对照。阳性对照产生了明显的抑菌圈,而空白对照未产生抑菌圈,说明抑菌实验具有充分的可信度和较好的效果。mCH显示出对革兰氏阳性和阴性细菌的抑制作用。 第五部分主要是两种hepcidin成熟肽基因的cDNA串联及其真核表达载体的构建。根据已有的斑点叉尾鮰hepcidin成熟肽基因mCH及尼罗罗非鱼hepcidin成熟肽基因mTH为模板,通过设计含有交叉互补序列的引物,利用SOE-PCR技术将mCH和mTH基因串联扩增得到156bp的mCH-mTH片段。根据mCH-mTH的序列,设计含Xho I和Xba I酶切位点的引物,扩增得到168bp的片段。对mCH-mTH和表达载体 pGAPZα A分别进行双酶切处理,利用 DNA重组技术,将mCH-mTH与表达载体pGAPZα A连接。经菌落PCR检验、双酶切鉴定及序列测定证实:成功构建了pGAPZα A-mCH-mTH重组表达质粒。
斑点叉尾鮰;抗菌肽;基因工程;重组DNA技术
上海海洋大学
硕士
生物化学与分子生物学
陶妍
2013
中文
S948
67
2014-01-22（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）