与人遗传病相关的DNA重复序列PCR条件优化及遗传不稳定性的研究
近年来,人们已经发现40余种人类神经系统疾病与DNA重复序列扩增或删除有关,这些疾病所涉及的重复序列的一个共同特点是以非孟德尔遗传方式在世代间发生动态突变,且往往伴随着遗传早现现象。 进行与人类遗传病相关的重复序列的遗传不稳定性的研究时,应用PCR检测重组质粒内含有的重复序列长度是一个基本的实验方法。我们采用L9(34)正交实验法,对与人神经系统疾病相关的DNA重复序列PCR扩增体系中的模板DNA浓度、Taq酶浓度、引物浓度、dNTP浓度等4种影响因素进行了优化筛选,发现引物浓度对扩增结果影响的显著性最大。在此基础上进行了引物浓度单因素实验,得到最优DNA重复序列PCR扩增体系在25μL反应体系中各组分的最适浓度分别为:模板3 ng/μL、Taq酶0.75 U、dNTP0.25 mmol/L、引物0.3μmol/L。通过优化前后反应体系的对比,扩增目的产物的量有较大程度的提高。该优化体系的建立为进一步研究和人遗传病相关的DNA重复序列的遗传不稳定性奠定了基础。 在研究人类神经系统疾病的遗传不稳定性及药物作用的影响时,需要制备成百上千的PCR样品进行定性检测重复序列的长度变化情况。为了探索含重复序列质粒PCR模板的快速简易制备方法,本文分别利用高速离心法、TE煮沸法和TE/SDS煮沸法处理过夜培养的含重组质粒大肠杆菌菌体,制备模板后进行PCR扩增发现,均能得到比较清晰的目的条带,可以用于含重复序列质粒的初步鉴定。相比较而言,高速离心5min、TE煮沸3min、TE/SDS煮沸2.5min制备的样品PCR扩增后效果较好。这三种方法快速、简便、费用低、无污染,简化了PCR模板制备的过程,为药物处理后重复序列长度大量鉴定的研究奠定了基础。 多核苷酸的重复只有超过一定的阈值时才可能导致遗传病的发生,如果能够控制重复次数从而抑制其扩增或运用一种方法使扩增的重复序列删除缩短,对于由 DNA重复序列引起的神经系统遗传病的治疗及预防具有非常重要的意义。我们利用丝裂霉素C和甲基磺酸乙酯两种化学药物,在10％的菌体存活率下,连续多次处理含重复序列(GAA)42、(ATTCT)43的重组质粒的大肠杆菌后,经检测其长度变化发现,两种化学药物在不同程度上都可以促使重复序列发生删除。丝裂霉素C处理9次、甲基磺酸乙酯处理13次后(GAA)42的删除率分别达到86.7%、43.3%,且删除后长度多数处于体内的正常范围。实验结果表明,化学药物可能促进与人遗传病相关的DNA重复序列的长片段发生删除,为研究该类疾病的致病机理及治疗方案奠定了一定的基础。
人类神经系统疾病;遗传不稳定性;DNA重复序列;PCR扩增体系;丝裂霉素C;甲基磺酸乙酯
包头医学院
硕士
生物化学与分子生物学
蔡禄
2010
中文
R596;R361.3
72
2013-12-10（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）