JSRV表面蛋白抗原表位的筛选及检测试剂盒的制备
研究背景：绵羊肺腺癌（ovine pulmonary adenocarcinoma，OPA）是由β-反转录病毒属绵羊肺腺瘤病病毒(jaagsiekte sheep retrovirus，JSRV）引起的一种传染性肺脏肿瘤性疾病，世界动物卫生组织将其列为 B类传染病。目前国内对该病的诊断主要依靠常规病理学方法检测，严重障碍了我国对OPA的防控。 主要目的：建立快速特异的实验室及适用于基层的诊断方法，为临床及基层检测诊断提供技术支持，为进一步分析表面蛋白(surface protein,SU）蛋白的功能、疫苗设计及对 JSRV的生物学特性研究提供素材。 研究方法：以获得的三株抗 JSRV-SU蛋白的单克隆细胞分泌的McAb为一抗，应用噬菌体展示结合肽探针扫描技术，鉴定三株单抗所识别的线性表位；并应用非竞争性 ELISA法测定三株单抗的功能性亲和常数；以阳性标准病料与健康阴性羊肺组织为样本，以纯化的多抗和单克隆抗体为基本检测试剂，建立双抗体夹心 ELISA检测方法；针对外源性 JSRV U3区设计特异性引物，建立 JSRV的环介导等温扩增(Loop-mediatedisothennala mplification,LAMP）检测方法，并以700ng健康羊基因组 DNA为背景进行敏感性和特异性试验；通过基因克隆技术对 JSRVenv及绵羊 ras基因进行序列测定；运用基因重组方法构建 JSRVenv重组真核表达质粒，并通过脂质体转染建立稳定表达细胞系。 研究结果： 1.三株单抗3B3、3D6、1D6的亲和常数分别为5.06×109 L/mol﹑5.82×109 L/mol﹑2.91×109 L/mol；且其所对应的抗原表位分别为W156APEGTPD163，F71SYQSQHPHCI81，D98EKTGKR104； 2.首次基于JSRV-SU蛋白的单抗建立了夹心 ELISA法，并建立了阴性与阳性的判定标准（当 P/N≥2.21时判为阳性；当 P/N<1.85时判为阴性；当2.21>P/N≥1.85时判为可疑）； 3.在国内首次基于内外源性病毒长末端重复序列(long terminal repeat,LTR）的差异建立了 LAMP诊断方法，所建立的反应体系在恒温水浴锅中作用60min即可得到其特有的阶梯状条带，而且对内源性 JSRV的扩增结果为阴性，该方法对 JSRV前病毒 DNA的最小检测限为10拷贝，灵敏性高于一步 PCR方法。LAMP和特异性 PCR及套式 PCR方法检测临床样品的符合率分别为92％和100%； 4.通过基因克隆技术对 JSRVenv及绵羊 ras基因进行序列测定，结果发现，本研究克隆的pMD-exJSRVenv1属于Ⅱ型 exJSRV；而 pMD-exJSRV env2属于Ⅰ型 exJSRV；在 exJSRV氨基酸序列中存在“YXXM”基序；绵羊ras基因与已知其他物种的该段基因作比对差异率较小，基本保守，且与牛的ras基因同源性最高； 5.成功构建了含有env及 tm基因的重组真核表达质粒 pcDNA3.1-env及 pcDNA3.1-TM-HA，并建立了稳定表达 JSRV囊膜蛋白（Env）及其 TM亚基的HepG2细胞系。 结论：本研究建立了特异性检测 JSRV的夹心 ELISA法和LAMP法，对于我国养羊业的健康发展，具有重要的实用价值，对研究 OPA防制措施等均有重要意义。另外，JSRV env基因的克隆和表达及对绵羊 ras基因的序列分析，对于丰富 JSRV的分子发病机理以及为进一步研究该蛋白与JSRV诱导 OPA发病关系搭建了重要的实验平台。
绵羊肺腺瘤病病毒;表面蛋白;抗原表位筛选;检测试剂盒
内蒙古农业大学
硕士
基础兽医学
马学恩;周建华
2011
中文
S858.26;S857.4
158
2013-09-18（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）