盐藻促有丝分裂活化蛋白激酶基因DsMAPK的克隆与表达
盐藻(Dunaliella salina)是研究植物耐盐机制的重要模式生物,而MAPK基因在植物耐盐分子途径中起重要作用。本文通过RT-PCR和RACE技术克隆了盐藻MAPK基因,将其命名为DsMAPK,利用荧光定量PCR技术检测了该基因在盐胁迫下的表达模式;构建了盐藻DsMAPK基因的真核表达载体,通过LiAc/PEG介导法将其转化到盐藻细胞中,实现了该基因的瞬时表达。这些结果对揭示盐藻应答盐胁迫信号的分子途径具有重要科学意义。研究结果如下: 1.应用简并PCR获得目的基因的中间片段,再根据中间片段设计特异性引物,采用SMART RACE技术从盐藻细胞中克隆到促有丝分裂活化蛋白激酶 MAPK基因,该基因的cDNA全长为1861bp,5′- UTR和3′-UTR分别为67 bp和387 bp,含有一个开放阅读框,长度为1407 bp,编码468个氨基酸(GenBank Accession JQ782412),将该基因命名为DsMAPK。 2.生物信息学分析显示,该基因编码蛋白的分子式为 C2286H3593N641O706S20,原子总数为7246,相对分子量为52 KDa,理论等电点为5.87,该蛋白为不稳定亲水性蛋白。无信号肽,无跨膜区域,为非跨膜蛋白,且定位于细胞质基质。二级结构预测表明,α螺旋和自由卷曲是其蛋白质二级结构的主要结构元件,伸展链散布其中;据氨基酸序列同源性分析表明,DsMAPK和衣藻、团藻的MAPK蛋白具有较近的亲缘关系。 3.应用QRT-PCR技术分析了DsMAPK在盐胁迫条件下的表达模式。结果表明,胁迫1h时,DsMAPK的表达量达到了最大值,为正常对照组的5倍,差异极显著(P<0.01)。说明DsMAPK基因的表达被盐诱导,是一种参与盐藻抵抗盐胁迫反应的快速上调基因。 4.以质粒pGEM.gfp.mcs.nos为模板扩增了绿色荧光蛋白基因GFP(含酶切位点Xbal I和Sal I),连接到pMDCKN-Cat载体上,构建表达载体pMDCKGN-Cat,以盐藻cDNA为模板,扩增DsMAPK基因的开放阅读框(含酶切位点BamH I和Xbal I)连接到表达载体pMDCKGN-Cat上,构建了DsMAPK的真核表达载体pMDCMGN-Cat。采用LiAc/PEG介导法将pMDCMGN-Cat载体在最佳条件(转化温度为29℃,载体浓度为600μg/ml,盐藻培养5d)下转化到盐藻细胞中,利用荧光显微镜观察到了MAPK和GFP在盐藻细胞中的瞬时表达。
盐藻;有丝分裂;活化蛋白激酶;DsMAPK基因;盐胁迫应答
大连海洋大学
硕士
海洋生物学
柴晓杰
2013
中文
S917.3
93
2013-09-18（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）