姜黄素类似物的抗氧化活性及其对PC12细胞氧化损伤保护作用的研究
自由基是具有非偶电子的基团或原子，在人体内积累到一定量时，攻击细胞膜、酶、糖类、DNA等，引起氧化损伤相关疾病，如老年性痴呆、帕金森病、肿瘤及炎症等。目前应用于临床上的抗氧化药物的疗效并不理想，急需更有效的抗氧化药物的发现。姜黄素（curcumin, Cur）是从姜科、天南星科中的一些植物的根茎中提取的二酮类化合物。近年来的研究发现，姜黄素的主要药理作用有抗氧化、抗炎、抗凝、降脂、抗动脉粥样硬化、抗衰老消除自由基及抑制肿瘤生长活性等。Cur具有结构简单，药理作用广泛，且基本无毒性等优点，但同时水溶性差、不易被吸收、代谢快、生物利用度低等缺点极大地限制了它的应用。因此，国内外许多学者都对Cur的结构进行了改造或修饰，多集中在苯环上取代基和β-二酮链上，合成一系列姜黄素衍生物或类似物。 基于以上背景的调研，本文在前期的研究基础上，为改善Cur化学性质不稳定及生物利用度差的问题，对Cur苯环上取代基和β-二酮链进行改造，设计合成了一系列α,β-苄亚基环酮化合物I1~30。本文将不对称α,β-苄亚基环酮类化合物用于抗氧化作用的研究，以期得到体内外稳定性好、且抗氧化活性保留或更强的化合物。化合物I1~25的结构均经过1H NMR、13C NMR和HR-MS分析确证，化合物I26~30的结构均经过1H NMR分析确证。 为了评价化合物 I1~30抗氧化能力的强弱，本文采用1,1-二苯基-2-苦基肼（DPPH·）清除法来检测其体外对自由基的清除能力，并建立 H2O2-PC12氧化损伤模型来评价其对神经细胞的保护作用。结果发现酚羟基被去除或被保护后的化合物I体外清除自由基的能力并不高，而结构中含有两个酚羟基的化合物I2（EC50=10.46μM）的清除DPPH·能力比Cur（EC50=14.24μM）强，酚羟基两侧被-C(CH3)3保护的I10（EC50=48.79μM）基本保持了Cur的离体清除自由基能力，I8结构中保留了Cur一侧苯环上的结构，对清除 DPPH·的 EC50为50.58mM，也基本上保持了 Cur的离体抗氧化能力。为进一步研究化合物 I1~20对氧化损伤的细胞的保护作用，本文选用150μM的H2O2作为氧化损伤的诱导浓度，作用时间是3 h，建立了H2O2-PC12（AD细胞模型）氧化损伤模型。各浓度化合物I分别预处理PC12细胞30 min后，再用150μM H2O2作用PC12细胞3 h，结果发现，相对于H2O2单独处理组，1.25μM、2.50μM、5.00μM、10.00μM浓度的I2提高了PC12细胞活力为5.98%、16.68%、47.05%、43.68%，I6提高了25.51%、28.58%、27.99%、35.15%，对应浓度的Cur则分别提高了22.03%、23.14%、25.13%、26.22%，说明化合物I6对H2O2损伤的PC12细胞保护作用均比Cur强，I2在低浓度（1.25μM、2.50μM）时对PC12细胞的保护作用要低于I6和Cur，高浓度（5.00μM、10.00μM）时保护作用则强于I6和Cur，这可能跟 I2自身的结构苯环上含有两个羟基很容易降解有关。另外，我们发现：羟基被保护后的化合物I6对离体的DPPH·清除作用和姜黄素相比并没有明显优势，而在H2O2-PC12氧化损伤细胞模型中，I6无论是低浓度还是高浓度时对PC12细胞均有较强的保护作用且强于阳性对照Cur。 本文分别从离体抗氧化活性和 AD细胞模型两个方面来共同阐明 MCH（I6）的抗氧化机制。离体抗氧化方面，本文采用了 DPPH·、超氧阴离子（O2-·）、羟基自由基（·OH）的清除和还原力检测等方法来综合评价MCH的抗氧化能力。结果显示，在480μM时MCH清除DPPH·能力为52.64%，比阳性对照Vit C（96.14%）和Cur（83.5%）的清除能力弱，比Vit E（19.2%）的清除能力强。MCH对O2-·、·OH的清除均具有浓度依赖性，随着MCH浓度的增加，清除能力增强。在浓度为160μM时， MCH对O2-·的清除率为62.1%，而Vit C和Cur的清除率为47.7%、43.8%；在0.125 mM时，MCH对·OH清除率为48.2%，阳性对照D-甘露醇为37.5%，进一步说明MCH具有很强的清除·OH和O2-·的能力。还原力检测方法发现在2.50μM、5.00μM时，MCH吸光度值分别是0.196、0.256，而Vit C分别为0.102、0.242，说明MCH在低浓度时还原能力比 Vit C强。以上各种自由基清除作用和还原能力检测说明了MCH具有一定的离体抗氧化能力。在AD细胞模型上，当5~80μM的MCH分别作用于PC12细胞时，对细胞不但没有损伤反而有一定促进生长的作用；H2O2单独作用于PC12细胞时，细胞活力显著下降到39.7%，加入0.63~5.00μM的MCH预处理后， PC12细胞存活率上升到69.8~82.1%。这些结果说明MCH具有明显的PC12细胞保护作用，与光学显微镜下观察到的细胞形态数量结果相一致。MCH能明显降低乳酸脱氢酶（LDH）漏出率及丙二醛（MDA）水平，即MCH能保护PC12细胞膜免受氧化损伤以及降低脂质过氧化水平。H2O2单独作用于PC12细胞时，与Control（100%）组相比，会使细胞内的活性氧（ROS）水平显著升高到426.1%，而线粒体膜电位（MMP）降低到48.3%；加入0.63~5.00μM的 MCH，胞内 ROS比 H2O2单独处理组降低了131.4~194.5%(p<0.01)，10μM的Vit E降低了184.9%(p<0.01)，MMP则明显提高了26.5~33.7%，而10μM的Vit E提高了38.3%(p<0.01)，这也说明MCH能显著地抑制H2O2引起的PC12细胞内的ROS含量上升，并能使 MMP逐渐上升恢复到正常水平。MCH在浓度为0.63~5.00μM时，使PC12细胞中谷胱甘肽（GSH）、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）活性随着浓度的增加而增强，且具有浓度依赖性。吖啶橙（AO）/溴化乙锭（EB）双染法对凋亡细胞的细胞形态及数量进行观察， AnnexinV-PI双染法流式细胞仪定量分析发现，在1.25~5.00μM浓度时，MCH对H2O2引起的PC12细胞凋亡数逐渐减少，具有明显的保护作用，与AO/EB染色后荧光显微镜下观察到的结果相一致。检测下游凋亡蛋白 caspase-3的表达水平，发现 MCH能下调H2O2引起的caspase-3的过表达。综合上述实验结果，本文初步认为MCH可能是通过调节抗氧化物质或抗氧化酶的合成，清除细胞内ROS，降低线粒体膜电位，并下调caspase-3的表达水平来抑制H2O2引起的PC12细胞氧化损伤。 综上所述，本研究设计合成了30个化合物（I1~30），对化合物的结构信息进行了表征，并将不对称α,β-苄亚基环酮类化合物用于抗氧化作用的研究，筛选出在AD细胞模型上抗氧化活性强且稳定性好的化合物MCH（I6），首次对该化合物的离体抗氧化活性和AD细胞模型上的抗氧化损伤机制进行探索，初步证实其抗氧化作用可能是通过ROS-caspase-3途径实现。本研究为开发活性姜黄素类似物提供可行的合成方法，为探讨新合成的姜黄素类似物的抗氧化活性机制提供理论依据和参考。
姜黄素类似物;抗氧化活性;细胞PC12;氧化损伤
苏州大学
硕士
药物化学
敖桂珍;王剑文
2013
中文
R965
73
2013-09-16（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）