DCs靶向温敏性siRNA纳米载体的体外评价
目的：利用siRNA干扰技术抑制树突状细胞中凋亡基因Bak的表达，在细胞水平上进行了siRNA抑制效果的评估。但是，siRNA的给药系统方面尚存不足，如靶向性低，转染率低和体内不稳定等因素。所以，设计有效负载靶向DCs中Bak基因的siRNA药物载体系统，对提高DCs的抗原提呈能力、促进免疫应答和增强抗肿瘤作用均具有非常积极的意义。本文基于DCs表面特异性表达的DEC-205受体，制备了负载siRNA的DEC-205抗体修饰的温度敏感性纳米胶束，并对其制剂学特征、细胞毒性、靶向性、摄取率、摄取机制、siRNA的内涵体逃逸及沉默效率和DCs存活率等方面进行评价，为构筑安全有效的抗肿瘤siRNA疫苗载体系统提供理论依据。 方法：首先，在前期研究的基础上，合成并表征了 DEC-205修饰的温度敏感性泊洛沙姆接枝壳聚糖聚合物（DEC-205-Po-CS），并对该聚合物纳米胶束的粒径、Zeta电位、包封率、温敏性、稳定性和细胞毒性进行了评价。其次，体外分离小鼠骨髓中单个核细胞，利用细胞因子诱导分化获得DCs，以Lipofectamine2000作为对照，通过流式细胞仪考察了DCs对负载FAM-siRNA的DEC-205-Po-CS纳米胶束的摄取率。原子力显微镜观察 DCs对纳米胶束的内吞作用，利用内吞抑制剂进一步阐释内吞的具体路径，荧光显微镜观察冷休克对细胞内涵体形态的影响。最后，利用Western Blot和 RT-PCR评价了 Bak基因沉默效率，并采用凋亡试剂盒测定了转染负载沉默 Bak的siRNA纳米胶束后DCs的存活率。 结果：红外光谱、核磁共振图谱及热重分析结果证实了泊洛沙姆接枝壳聚糖聚合物的合成，其 CMC值为（1.20±0.10）×10-6 mol·L-1。制备的载药纳米胶束粒径为（230.9±3.9）nm，Zeta-电位为+（14.57±1.12）mV，包封率为（85.6±2.37）%，重现性均良好。流式细胞仪检测表明DEC-205修饰纳米胶束可提高DCs的摄取率。原子力显微镜观察 DCs通过内吞作用摄取纳米胶束，主要是网格蛋白介导的内吞，少部分是小窝蛋白介导内吞，并且是一个消耗能量的内吞过程。荧光显微镜观察冷休克后温敏性纳米载体膨胀，导致内涵体破裂，实现siRNA从内涵体逃逸。Western Blot结果证明，负载siRNA的DEC-205-Po-CS纳米胶束转染imDCs3 h后进行冷休克，并且冷休克的时间为15 min时，蛋白的表达量较低，蛋白表达抑制率为（81.81±6.89）%；RT-PCR结果表明，脂质体2000转染组；DEC-205-Po-CS转染组；DEC-205-Po-CS转染加冷休克组对DC细胞Bak基因有明显的抑制作用，均能显著下调Bak mRNA的表达。流式细胞仪检测 DCs凋亡结果，DEC-205-Po-CS加冷休克组 DCs存活率（73.62±3.93）%，明显高于对照组（28.89±3.09）%和脂质体2000转染组（42.84±2.53）%。 结论：本文制备了温度敏感性 DEC-205修饰的泊洛沙姆接枝壳聚糖聚合物纳米胶束，未见明显细胞毒性。温度敏感性纳米胶束能有效负载siRNA特异性靶向DCs，提高细胞摄取率。树突状细胞通过网格蛋白和小窝蛋白介导的内吞摄取纳米胶束，冷休克实现了siRNA的内涵体逃逸。利用siRNA干扰技术抑制了树突状细胞中凋亡基因Bak的表达，延长了的DCs寿命。
siRNA干扰技术;树突状细胞;凋亡基因Bak;DCs靶向温敏性;纳米载体;体外评价
苏州大学
硕士
药剂学
崔京浩
2013
中文
TQ460.1
82
2013-09-16（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）