白花丹醌对大鼠肝纤维化HSEC干预作用及其机制的研究
目的：研究白花丹醌对CCl4联合乙醇的大鼠肝纤维化模型干预作用，观察白花丹醌干预前后大鼠肝纤维化模型肝脏HSEC窗孔数目、基底膜结构变化，以及相关细胞因子内皮素-1（END-1）、血管内皮细胞生长因子（VEGF）、结缔组织生长因子（CTGF）等干预前后的变化。进一步探讨白花丹醌逆转肝纤维化的机制，为白花丹醌治疗肝纤维化作出理论和实验依据。 方法：1.肝纤维化模型的制备：SD大鼠200只，雌性大鼠120只，雄性大鼠80只。随机抽取20只做空白对照组，空白对照组皮下注射生理盐水，2次/周，连续4周，用量0.3ml/100g。其它大鼠皮下注射40%CCl4花生油，用量0.3ml/100g，第一次注射量加倍，2次/周，连续4周，造模期间大鼠仅食用含10%乙醇饮水。4周后，随机抽取8只大鼠做肝组织病理HE染色，证实肝纤维化模型已经建立成功。然后将造模成功的肝纤维化大鼠随机抽取分组每组18只分别为：白花丹醌高剂量组，白花丹醌中剂量组，白花丹醌低剂量组，秋水仙碱组，丹参酚酸B组，模型对照组，分别继续造模并且同时灌胃给药。第11周末将大鼠全部处死进行解剖，取其肝脏和血液标本进行相关指标检测。 2.全自动生化仪分析血清ALT、AST、TBIL、ALP的含量变化。 3.放射免疫法测定血清HA、P3NP、LN、CIV含量变化。 4.HE染色肝组织观察肝纤维化程度及分期评分。 5.电子显微镜观察HSEC超微结构特征。 6.逆转录RT-PCR检测相关细胞因子mRNA含量的改变。 结果：第一部分白花丹醌干预肝纤维化大鼠模型后肝功能相关指标及 HE染色肝纤维化程度的改变 1.全自动生化仪分析血清ALT、AST、TBIL、ALP的含量变化：肝功能检测结果证实在第11周末用药各组与模型对照组比较，血清 ALT、AST、TBIL、ALP值均下降，均有极显著性差异(P＜0.01)；其中白花丹醌低剂量组第11周，随着用药时间的延长，ALT、AST、TBIL、ALP值逐渐降低，第11周末血清ALT、AST、TBIL值与秋水仙碱、丹参酚酸B阳性对照组比较，有显著性差异(P＜0.05)，ALP值与秋水仙碱、丹参酚酸B阳性对照组比较，无显著性差异(P>0.05)。 2.放射免疫法测定血清HA、P3NP、LN、CIV含量变化：肝纤维化四项检测结果证实在第11周末用药各组与模型对照组比较，血清HA、P3NP、LN、CIV值均下降，均有极显著性差异(P＜0.01)；其中白花丹醌低剂量组第11周，随着用药时间的延长，HA、P3NP、LN、CIV值逐渐降低，第11周末血清HA、P3NP、LN、CIV值与秋水仙碱、丹参酚酸B阳性对照组比较，差异有统计学意义(P＜0.05)。 3.HE染色肝组织观察肝纤维化程度：空白对照组肝组织小叶结构完整，轮廓清楚，肝细胞条索排列整齐，肝窦清晰。汇管区小叶间动脉、静脉和小叶间胆管未见扩张、增生，也未见管腔狭窄、炎细胞浸润和纤维组织增生。模型对照肝组织肝出现纤维化，肝小叶结构不同程度破坏，肝小叶内及汇管区出现不同程度的纤维组织增生，少许炎细胞浸润，个别肝脏出现肝硬化，肝组织小叶结构破坏，原有肝小叶结构被纤维组织增生分割及包绕形成大小不等的圆形、椭圆形肝细胞团即形成假小叶。白花丹高剂量组肝细胞脂变（肝细胞脂肪变性）：肝细胞胞质内出现脂滴，脂滴的大小不导致肝细胞外观大小不一，最终引起肝细胞排列紊乱。肝细胞广泛重度脂变，以中央 V为甚。白花丹醌中剂量组肝细胞大片中度脂变，以汇管区为主，肝细胞广泛轻-中度水肿。白花丹醌低剂量组肝细胞出现水肿，肝细胞胞质水份过多，体积增大，胞浆淡染色，透亮度增加。秋水仙碱组肝细胞广泛轻度水肿。丹参酚酸B组肝细胞出现轻中度中度片状脂变。 4. HE染色肝组织观察肝纤维化程度分期评分结果：与模型对照组比较各用药组均可降低大鼠的肝纤维化评分，积分比较均有极显著性差异(P＜0.01)；白花丹醌低剂量组与阳性对照组丹参酚酸B组比较，有显著性差异(P＜0.05)，与秋水仙碱组比较无显著性差异(P>0.05)。 第二部分白花丹醌干预肝纤维化大鼠模型后 HSEC超微结构特征的改变 电子显微镜进行 HSEC超微结构特征观察结果：空白对照组肝脏HSEC呈筛孔状结构，有大量大小不一的窗口，大窗孔直径约为1μm，小窗口约为0.1μm，皮下无基底膜；模型对照组HSEC窗口消失或大量减少，出现连续基底膜；白花丹醌高剂量组窦壁上窗口数量增多不明显，且窗口直径变大，基底膜减少不明显，内皮下基底膜成比连续状；白花丹醌中剂量窗口数量增多，窦壁成筛孔状，基底膜减少不明显；白花丹醌低剂量组窗口数量增多，窦壁成筛孔状与中剂量组比较窗孔更多，基底膜减少明显；秋水仙碱组和丹参酚酸B组窗口数量有少量增多，基底膜变化不明显； 第三部分白花丹醌干预肝纤维化大鼠模型后相关细胞因子mRNA含量的改变 1.凝胶电泳观察三种细胞因子CTGF、VEGF、END-1的mRNA在模型对照组的表达量均有明显升高，药物干预后三种细胞因子的mRNA表达量均有下降。 2.光密度分析结果，用药后各组细胞因子CTGF、VEGF、END-1的mRNA的表达量降低，与模型对照组比较均有极显著性差异（P<0.01），其中白花丹醌低剂量组CTGF、VEGF的mRNA表达含量与阳性对照组秋水仙碱和丹参酚酸比较，有显著性差异或极显著性差异（P<0.05或P<0.01），END-1的mRNA表达含量比较无显著性差异（P>0.05）。 结论： 1.白花丹醌低剂量组在保护肝功能，降低肝纤维化程度，逆转其病理变化，效果显著。 2.白花丹醌低剂量组在恢复HSEC窗孔数目，改变HSEC基底膜结构变化较其他给药组效果明显。对细胞因子CTGF、VEGF、END-1mRNA含量有抑制作用。 3.白花丹醌本身具有毒性，服用时间和剂量需要慎重，否则就会出现中毒症状（本实验白花丹醌高、中剂量组均在服用10周后出现中毒症状）。
白花丹醌;肝纤维化;干预作用;超微结构
广西中医药大学
硕士
药理学
赵铁建
2013
中文
R575.2;R285.5
72
2013-09-16（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）