氧化还原敏感型聚酰胺-胺及其胆固醇衍生物作为siRNA递送载体的研究
小干扰RNA(siRNA)是一种含有21~23个碱基对的双链RNA,利用siRNA作为RNA干扰(RNAi)的效应分子在治疗疾病时具有特异性好、效率高、持续时间长等特点,因此 siRNA在疾病治疗方面(如癌症、遗传性疾病或病毒感染性疾病等)展现出良好的潜力和发展前景。但siRNA分子量较大、水溶性好、荷负电、易被RNA酶降解、且易受细胞膜屏障的影响导致基因沉默效率较低,严重限制了 siRNA在疾病治疗中的广泛应用。因此,探索和研发安全有效的非病毒载体系统用于递送siRNA并实现基因治疗是一个亟需解决的难题。 本研究设计并合成了一种聚酰胺-胺(rPAA)高分子材料,其结构特征为:(1)聚合物链中含有多种不同类型的氨基,有利于增强载体的溶酶体逃逸能力;(2)聚合物链中含有较丰富的二硫(S-S)键,利用其在特定的氧化-还原环境中可产生聚合链裂解,从而具有良好的解组装能力,利于有效释放 siRNA。我们利用该rPAA聚合物材料单独或与其它聚合物(如透明质酸,HA)共同构建功能性siRNA递送载体,以期通过提高递送载体的细胞摄取能力、增强载体的溶酶体逃逸能力以及改善载体的胞内解组装能力等技术手段,显著改善 siRNA递送效率。在此rPAA聚合物结构基础上,我们又通过化学修饰的方式将胆固醇分子以两种不同的接枝方式修饰到rPAA聚合链上获得rPAA-Ch和rPAA-ChBr两类聚合物,并对这些聚合物及其组装的载体系统的制剂学性质和生物学性能进行了较为系统的体内外评价,以期进一步寻找和探索更加高效安全的siRNA递送载体。本课题的研究内容主要包括以下四个部分: (1) rPAA合成工艺的优化 考察了单体的浓度、两种单体的摩尔比、反应时间和温度等因素对rPAA的平均分子量(Mw)和分子结构(线性或支化)的影响,结果显示:在一定反应时间范围内,随着反应时间的延长,rPAA的平均Mw逐渐增加;两种单体在较高的摩尔浓度且摩尔比为1:1时,更容易获得较高Mw的聚合物。另外,反应温度也会明显影响产物分子结构:在较高的反应温度下(如55℃),易得到高支化rPAA;在较低的反应温度下(如37℃),易得到直链rPAA。由此可见,通过对合成反应工艺条件和参数的优化,可获得分子量可调节、支化程度可控的合成工艺,为后续siRNA递送载体材料的研究奠定了良好的基础。 (2)以高支化rPAA和HA为载体构建siRNA三元复合物的研究 本研究合成了一种高支化结构的rPAA(命名为PCD),与siRNA和HA组装形成 siRNA/PCD/HA三元复合物递送载体,并比较了该三元复合物的三种不同混合顺序的组装方式在生物学性质评价中的差异:(1)混合方式I(mixing order I),将siRNA溶液与PCD溶液进行混合得到二元复合物,然后再加入HA溶液进行混合得到三元复合物。(2)混合方式II(mixing order II),将HA溶液与PCD溶液进行混合得到二元复合物,然后加入siRNA溶液进行混合得到siRNA三元复合物。(3)混合方式III(mixing order III),将HA溶液与siRNA溶液进行混合,然后加入 PCD溶液进行混合得到 siRNA三元复合物。以乳腺癌细胞系 MCF-7(低CD44表达)和MDA-MB-231(高CD44表达)细胞为模型,考察了不同混合顺序(I、II、III)组装形成的纳米粒子在粒径、电位、细胞摄取、血清稳定性和siRNA递送效率等方面的差异,研究结果显示:合成PCD高分材料在上述两个细胞的细胞毒性低于市售转染试剂bPEI25 kDa,而其缓冲能力和细胞转染效率均明显高于bPEI25 kDa,且PCD可表现出在氧化-还原环境条件下特异性释放siRNA。 在三组分混合顺序考察中发现,在较优 siRNA/PCD/HA的电荷比(P/N/C)为1/20/16时,三种混合方式所制备粒子的粒径和电位分别为124.8 nm和27.3 mV(混合方式I),147.5 nm和29.9 mV(混合方式II),128.8 nm和19.4 mV(混合方式III)。研究还发现:混合方式I和III制备的三元复合物载体对siNRA的保护效果(血清稳定性)和在上述两个细胞系内的细胞摄取都要优于混合方式 II制备的三元复合物载体。在较优的电荷比(P/N/C)为1/20/16时,在 MDA-MB-231细胞内,血管内皮生长因子(VEGF)的基因沉默效率呈如下趋势:混合方式III>混合方式 I>混合方式 II。由此可见,siRNA/PCD/HA三组分均可按层层组装(layer-by-layer)的方式依赖静电作用形成纳米粒子,不同混合顺序组装得到的纳米粒子具有不同的结构特征,进而导致不同的细胞摄取和 siRNA递送效率。这些研究结果对于三元复合物处方工艺的优化具有重要的指导意义。 (3)胆固醇修饰的rPAA-Ch聚合物作为siRNA递送载体的研究 本研究利用胆固醇氯甲酸酯与rPAA主链上的仲胺以形成酰胺键的方式合成两亲性rPAA-Ch聚合物。通过调整胆固醇氯甲酸酯和rPPA的投料比,我们获得了不同接枝率的rPAA-Ch聚合物,包括rPAA-Ch14(接枝率为14％)、rPAA-Ch29(接枝率为29%)、rPAA-Ch57(接枝率为57%)和 rPAA-Ch87(接枝率为87%)。这些两亲性rPAA-Ch聚合物均可在较低的浓度下在水溶液中自组装形成纳米粒子,通过冷冻透射电镜(Cryo-TEM)和动态光散射技术(DLS)证实了自组装纳米粒子的形成。rPAA-Ch空白纳米粒的粒径在80-160 nm之间,电位为50-60 mV。四种不同胆固醇接枝率的rPAA-Ch聚合物的体外性质评价结果显示,随着胆固醇接枝率的增加,载体材料的毒性逐渐降低、载体的细胞摄取逐渐增加,缓冲能力逐渐减弱,CMC值逐渐减小。以人乳腺癌MCF-7细胞和人肝癌Hep G2细胞为模型,不同材料对 siRNA的体外递送效率从高到低依次是:rPAA-Ch57>rPAA-Ch87>rPAA-Ch29>rPAA-Ch14≥rPAA。在以MCF-7乳腺癌细胞为模型的考察研究中发现,rPAA-Ch57载体具有较高的细胞摄取,最好的VEGF基因沉默效率和最优的MCF-7肿瘤生长抑制效果。胆固醇抑制试验和内吞抑制剂试验进一步证实rPAA-Ch57载体较优的siRNA递送效率与其结构中胆固醇含量相关,该纳米载体粒子可通过网格蛋白介导的和陷穴小泡介导的内吞方式进入细胞,然后经过内涵体-溶酶体途径;共聚焦显微镜研究发现rPAA-Ch57纳米载体具有良好的溶酶体逃逸能力和载体解组装能力,有利于递送载体从溶酶体逃逸进入胞浆内释放siRNA,进而发挥基因沉默效应。这些结果表明,rPAA-Ch57聚合物是一个具有较好发展潜力的siRNA递送载体材料。 (4)胆固醇修饰的rPAA-ChBr聚合物作为siRNA递送载体的研究 本研究通过形成溴化季铵盐的方式将胆固醇分子化学修饰到rPAA主链上并获得四种不同接枝率的rPAA-ChBr聚合物,包括rPAA-ChBr15(接枝率为15%)、rPAA-ChBr30(接枝率为30%)、rPAA-ChBr60(接枝率为60%)和rPAA-ChBr90(接枝率为90%)。通过动态光散射技术(DLS)证实了空白自组装纳米粒子的形成。考察了不同胆固醇接枝率对聚合物的理化性质、细胞毒性、细胞摄取、siRNA递送效率等方面的影响,研究结果显示:随着胆固醇接枝率的增加,rPAA-ChBr空白纳米粒的粒径(从150 nm增加至350 nm)和电位(从60 mV到100 mV)逐渐增加;CMC和缓冲能力逐渐降低。以MCF-7乳腺癌细胞为模型,评价比较了四种rPAA-ChBr材料促进 siRNA细胞摄取能力:Lipofectamine> rPAA-ChBr60≈rPAA-ChBr30>rPAA-ChBr15≈rPAA≈PEI25k>rPAA-ChBr90。以MCF-7乳腺癌细胞和Hep G2肝癌细胞为模型,考察四种rPAA-ChBr/siRNA载体系统在细胞水平上的基因沉默效率:rPAA-ChBr30> rPAA-ChBr15> rPAA-ChBr60>rPAA-ChBr90。上述结果表明,rPAA-ChBr30也可能是一个具有发展潜力的siRNA递送载体。 综上所述,本研究合成了一种具有良好发展潜力的氧化还原敏感型聚酰胺-胺高分子材料(rPAA),并在此材料基础上,考察评价了不同混合组装方式的三元复合物在载运siRNA效率上的差异;同时研究了在rPAA母链结构上不同胆固醇修饰方式和不同胆固醇接枝率对siRNA递送效率的差异。研究结果证实,rPAA高分子材料具有良好的氧化还原敏感性,具有良好的siRNA包载和递送能力,其胆固醇修饰的衍生物将有可能开发成为具有良好运载 siRNA效能的新型非病毒载体材料,为进一步设计开发可显著改善siRNA体内功效的载体系统奠定良好的研究基础。
小干扰RNA递送载体;聚酰胺-胺高分子材料;胆固醇衍生物;合成工艺;化学修饰;生物活性
北京大学
博士
药剂学
吕万良;王坚成
2013
中文
TQ460.6
166
2013-07-22（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）