矮牵牛F3',5'H基因的克隆及菊花的转基因研究
在花色研究上，蓝色花卉因其色彩高雅、稀少而成为研究的重点。影响花色的因素很多，而飞燕草色素的积累被认为是产生蓝色花的必要条件之一。虽然自然界中的花色种类繁多，但是菊花、玫瑰、康乃馨、郁金香等重要的花卉却缺少蓝色和紫色。此外，传统育种技术虽然对花色改良作出了很大贡献，但难于打破生物物种的生殖隔离，且育种周期长，效果不理想；因此，利用基因工程技术向花卉植物中引入编码飞燕草色素的关键酶基因成为培育蓝色花卉品种的一个重要手段。有研究表明，F3′,5′H基因是编码飞燕草色素的关键酶基因之一；CHS基因编码查尔酮合成酶，而查尔酮合成酶是花色有关的类黄酮合成的第一关键酶。 菊花是我国十大传统名花和世界四大切花之一，但菊花缺乏蓝色花色；此外，镶嵌色菊花也非常珍稀。为此，本研究以菊花为研究对象，首先从蓝色矮牵牛花瓣中克隆出 F3′,5′H全长cDNA，进一步开展了菊花转F3′,5′H和CHS基因的研究。论文研究内容与结果如下。 1、F3′,5′H全长cDNA的获得和生物信息学分析 通过 RT-PCR从蓝色矮牵牛花瓣中克隆获得长度为1773 bp的F3′,5′H全长 cDNA（GenBank登录号：EF371021）。生物信息学分析表明克隆获得的F3′,5′H基因与GenBank登录号D14588、Z22545和DQ352142等的F3′,5′H基因序列高度一致；其编码的氨基酸序列与GenBank登录号BAA03438(矮牵牛)、BAC10997(银杯草)和AAV85470(马铃薯)高度同源，相似率分别为99％、88%和87%。 2、F3′,5′H基因表达载体的构建和农杆菌菌株的转化 利用pBIN19、pBluscript SK(+)(简称为pBS)、pBS-35S和pMD18-PchsA分别构建了组成型启动子35S和花特异性启动子PchsA驱动F3′,5′H基因的表达载体pBIN19-35S-F3′,5′H和pBIN19-PchsA-F3′,5′H，并导入了野生型发根农杆菌K599和根癌农杆菌GV3101。 3、发根农杆菌K599介导的菊花转基因研究 利用发根农杆菌 K599（分别含有质粒 pCHS、pBIN19-35S-GFP、pBIN19-35S-F3′,5′H和pBIN19-PchsA-F3′,5′H）介导，通过改良的叶盘法，建立了高效诱导菊花转基因不定根体系，转基因不定根的频率分别为40%、34.5%、25%和30.7%，而进一步的植株分化还在进行之中。 4、根癌农杆菌GV3101介导的菊花转基因研究 利用根癌农杆菌GV3101（分别含有质粒pCHS、pBIN19-35S-GFP、pBIN19-35S-F3′,5′H和pBIN19-PchsA-F3′,5′H）介导，通过优化后的叶盘法侵染菊花幼茎，建立了菊花根癌农杆菌介导的转基因再生体系，共获得转化植株10株，其中，JN-CHS2株、JN-GFP3株、JN-F3′,5′H3株和JN-PchsA-F3′,5′H2株。 根据35S启动子、CHS、GFP、PchsA花特异性启动子和F3′,5′H基因序列分别设计特异引物，对转化植株进行了PCR鉴定。Southern Blot结果显示，在转化株中，F3′,5′H和CHS基因均为2-3个拷贝。转基因植株花色有待进一步的分析。 本研究结果为菊花花色遗传改良奠定了重要的前期基础。
矮牵牛;基因克隆;菊花;转基因工程;CHS基因编码查尔酮合成酶
杭州师范大学
硕士
遗传学
向太和
2009
中文
S681.6;S682.11
69
2013-05-23（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）