深海细菌Shewanella piezotolerans WP3细胞色素c相关基因的克隆表达和功能鉴定
深海是一个特殊的生态环境，这里永久高压、低温、黑暗、高盐和寡营养。生活在这些环境下的极端微生物必然有特殊的生理代谢途径来适应极端环境。对深海微生物的研究不仅有助于了解生命的起源，而且可以了解各种极端微生物的生活特性，为深海微生物资源的开发利用奠定基础。 2003年本实验室在西太平洋暖池区1914米的沉积物中分离到一株具有异化金属还原能力的耐压低温细菌，菌种鉴定为希瓦氏属新种，命名为 Shewanella piezotolerans WP3（以下简称 WP3）。WP3全基因组测序已经完成，并对其环境适应性机制做了功能基因组学分析。WP3拥有众多的基因和基因簇来帮助它适应极端环境。特别的是，WP3中包含55个编码细胞色素c的开放读码框（ORFs），是目前已测序Shewanella属菌株中最多的。 通过对WP3细胞色素c基因序列进行BLAST比对分析，推测在异化金属还原过程中，WP3可能存在两套电子传递系统，即mtrCAB基因簇和mtrFED基因簇。当WP3分别以延胡索酸和二氧化锰为唯一电子受体生长时，通过提取细胞总RNA并将mRNA反转录成cDNA，然后以cDNA为模板进行实时荧光定量PCR（RT-PCR），确定了细胞色素c相关基因转录水平的差异。结果表明，在二氧化锰还原过程下，mtrFED基因簇转录水平显著上调。这说明mtrFED基因簇可能在异化金属还原过程中起着重要作用。 由于WP3的mtrFED基因敲除突变株未观察到二氧化锰还原能力的显著下降，推测mtrFED基因簇在异化金属还原过程中可能只是起着辅助作用。为证实mtrFED基因簇在电子传递中的作用，首先借助生物信息学工具，对mtrFED基因簇的表达产物即细胞色素c蛋白进行了预测，包括它们的理化性质，跨膜区段，信号序列和功能结构域等；随后设计引物，对细胞色素c相关基因在体外进行了克隆表达，并在大肠杆菌中成功表达了具有氧化-还原活性的细胞色素c。 同时，本论文发展了一种基于删除信号肽的策略来过量表达这些膜蛋白，并采用Qiagen公司的Ni-NTA柱式纯化方法将其纯化。随后，已得到纯化的蛋白被用来制备抗体，通过免疫印迹杂交的方法，以期对目的蛋白在细胞内的表达水平和在细胞膜上的位置进行确定，为阐明WP3异化金属还原机制奠定基础。
希瓦氏属WP3新种;异化金属还原;细胞色素c;基因表达;分离纯化;功能鉴定;深海微生物
哈尔滨工业大学
硕士
微生物学
王爱杰
2009
中文
Q93-331;Q933;X172
33
2013-03-20（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）