琼胶酶的发酵条件优化、表达调控和酶学性质研究
琼胶酶是一种能够催化琼胶水解的酶。根据琼胶的裂解方式不同,琼胶酶可以分成α-琼胶酶(E.C.3.2.1.158)和β-琼胶酶(E.C.3.2.1.81)两类。琼胶酶水解琼胶产生的琼胶低聚糖具有显著的生物活性,因此琼胶酶在食品、化妆品工业和医药领域都有广泛的应用。此外,琼胶酶还被用作生理学、生物学以及细胞学研究的工具酶。 本文利用琼胶为唯一碳源,从青岛近海海域的海草样品中筛选分离到6株海洋琼胶降解细菌。对6株海洋菌株进行发酵培养,采用DNS法测得了它们的胞外琼胶酶活性,克隆其16SrDNA序列进行分子鉴定并测得了部分生理生化特征指标。从鉴定结果来看,初步判断6株菌分别属于6种不同菌属,其中OAG04的属别未确定,还需进一步的研究鉴定,OAG07与实验室保藏的一株海洋琼胶降解菌Agarivorans gilvus WH0801属于同一个属。 Agarivorans gilvus WH0801是杜宗军等从威海海岸的新鲜海藻样本中筛选出的一株具有高效琼胶降解能力的菌株,对该菌株的发酵产琼胶酶条件进行了优化并对该酶的酶学性质进行了初步研究。首先初步确定酶活测定的最佳时间为48h。然后通过Plackett-Burman设计及Box-Behnken设计实验,对菌株Agarivorans gilvus WH0801发酵产琼胶酶的条件进行了优化。Plackett-Burman设计表明琼脂粉、酵母粉和种龄三个因素对琼胶酶产量具有显著影响。Box-Behnken设计实验确定此三个因素的最适水平为:琼脂粉2.50g/L、酵母粉0.88g/L、种龄25.64h。其它因素水平分别为蛋白胨1g/L、柠檬酸铁0.01g/L、初始pH7.0、培养温度28oC。经优化后,酶活最大值为1.158U/mL,比优化前的酶活提高了约6.2倍,与已报道的琼胶酶产生菌的酶活相比具有较大的优势。另外,我们还通过单因子实验,确定了酶解反应的最适温度为45oC;最适底物浓度为1％;在pH7.0-8.0的范围内,酶解反应的最适pH为7.6。 工程菌株E.coli BL21-pETAg2由华东理工大学提供,是通过对菌株Agarivorans gilvus WH0801中编码琼胶酶的基因克隆并转化到大肠杆菌BL21得到的。本文我们对该工程菌进行了发酵条件优化和酶学性质研究,最终实现了重组琼胶酶的高效表达。
琼胶酶;发酵培养;条件优化;表达调控;酶学性质
齐鲁工业大学;山东轻工业学院
硕士
生物化工
刘新利;毛相朝
2012
中文
Q556
85
2012-11-28（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）