外源性硫化氢通过抑制炎症和凋亡途径保护创伤失血性休克大鼠心肌组织的研究
创伤失血性休克（hemorrhagic traumatic shock，HTS）是平、战时创伤导致死亡的主要原因之一，其主要损伤机理是，当机体遭受严重创伤后，通过“血管—神经”反射所引起的以微循环障碍为标志的急性循环功能障碍，并由此导致组织器官的缺血、缺氧和多器官功能障碍综合征（multiple organ dysfunction syndrome，MODS）。如何快速有效地预防和治疗创伤失血性休克过程中的缺血再灌注损伤，平衡组织供氧-耗氧的关系，抑制由于其损伤造成的各种器官功能障碍及其并发症是决定疾病转归的关键问题。 20世纪90年代，硫化氢（H2S）已被证实是继一氧化氮（NO）和一氧化碳（CO）之后的第三种生物气体信号分子，内源性H2S在机体的生理及病理过程中具有众多作用，如血管活性调节、抑制炎症反应、抗氧化等，并且具有强烈的抑制代谢效应，可迅速降低机体的氧代谢，调节氧供-氧需平衡，有利于细胞存活并防止不可逆损伤。研究表明，创伤失血性休克导致的心肌损伤与NF-κB的活性密切相关，而相关研究报道外源性H2S可以抑制NF-κB的表达；同时外源性H2S可以明显改善严重失血性休克导致的心肌梗死，减轻缺血再灌注损伤诱导的心律失常，降低心跳停止和心肺转流术后的心肌细胞凋亡和自噬现象。 本课题组在前期研究中已证实外源性H2S能明显改善创伤失血性休克导致的继发性肺损伤，并初步验证了外源性 H2S对炎症反应有抑制作用。本实验拟在创伤失血性休克大鼠模型中，给予外源性H2S供体NaHS（sodium hydrosulfide）28μmol/kg处理，进一步观察H2S对HTS大鼠心肌组织的保护作用，研究H2S对创伤失血性休克大鼠炎症反应的抑制作用，和对凋亡相关蛋白的影响，深入探讨其心肌保护作用的机制。 目的： 建立大鼠创伤失血性休克模型，观察新型气体信号分子硫化氢(H2S)对创伤失血性休克大鼠心肌组织的保护作用，深入探讨外源性H2S通过抑制炎症和凋亡途径保护创伤失血性休克大鼠心肌组织的机理，为外源性H2S在临床中的应用提供理论及实验依据。 方法： 1．成年雄性SD大鼠40只，体重250-300g，随机分成4组（n=10）；假手术组（SHAM），假手术+NaHS组(SHAM+NaHS)，模型组(HTS)，模型+NaHS组(HTS+NaHS)。建立创伤失血性休克模型，SHAM组完成所有手术操作，但不放血不复苏；模型组与NaHS治疗组在10分钟内抽出约为60％血容量的血液，此时为最大抽血量（MDO），使血压迅速降至35-40 mmHg，并通过股经脉缓慢推注约为40％MDO的Ringer’s液，维持35-40 mmHg的血压1.5小时，HTS+NaHS组在复苏前10min腹腔注射NaHS28μmol/kg；SHAM+NaHS组亦不放血不复苏，在与HTS+NaHS组相同时刻腹腔注射NaHS28μmol/kg；HTS组完成所有手术操作后放血并复苏。 2．术中持续监测各组大鼠平均动脉压（MAP）。 3．在不同时间点收集大鼠血液样本测定血清CK、LDH浓度及TNF-α和IL-6水平。 4．复苏后4小时制备大鼠心肌组织切片，常规苏木精-伊红（hematoxylin and eosin，HE）染色，观察创伤失血性休克复苏后心肌病理形态学的变化。 5．复苏后4小时制备大鼠心肌组织电镜切片，观察创伤失血性休克复苏后心肌细胞超微结构变化及线粒体形态学改变。 6．采用Western-Blot法测定心肌组织IKK/IκB/NF-κB及HMGB1的表达。 7．以蛋白印记法观察大鼠心肌组织Survivin(生存素)以及促凋亡因子Caspase-3与Bax的表达变化。 结果： 1．与SHAM组和SMAM+NaHS组相比，HTS组和HTS+NaHS组MAP明显降低（P<0.05）；与 HTS组相比，HTS+NaHS组 MAP均有明显改善（P<0.05）。 2．与SHAM组和SMAM+NaHS组相比，HTS组和HTS+NaHS组血清中CK和LDH浓度明显升高（P<0.05）；与HTS组相比，HTS+NaHS组血清中CK和LDH浓度明显下降（P<0.05）。 3．与SHAM组和SHAM+NaHS组相比，HTS组和HTS+NaHS组血清TNF-α和IL-6水平升高(P<0.05)；与HTS组相比，HTS+NaHS组血清TNF-α和IL-6水平降低(P<0.05)。 4．光镜下，SHAM组与SHAM+NaHS组心肌结构清晰整齐；HTS组心肌细胞肿胀明显，心肌纤维染色不均，心肌空间结构排列紊乱；与HTS组相比，HTS+NaHS组心肌结构较完整，组织间隙较有规律。 5．电镜下，SHAM组与SHAM+NaHS组心肌细胞和线粒体结构完整；HTS组心肌细胞和线粒体结构破坏，表现为心肌横纹边界不清，肌小节排列紊乱，线粒体肿胀，基质出现空泡，嵴减少或断裂，内膜完整性破坏，肌浆网肿胀；与HTS组相比，HTS+NaHS组心肌细胞超微结构改变明显减轻。 6．与SHAM组和SHAM+NaHS组相比，HTS组和HTS+NaHS组心肌组织磷酸化IKKβ和磷酸化IκBα蛋白表达升高(P<0.05)；与HTS组相比， HTS+NaHS组磷酸化IKKβ和磷酸化IκBα蛋白表达降低(P<0.05)。 7．与SHAM组和SHAM+NaHS组相比，HTS组和HTS+NaHS组总NF-κB蛋白含量差异无统计学意义；HTS组和HTS+NaHS组磷酸化NF-κB蛋白含量增加(P<0.05)；与HTS组相比，HTS+NaHS组磷酸化NF-κB蛋白含量减少(P<0.05)。 8．与SHAM组和SHAM+NaHS组相比，HTS组和HTS+NaHS组总HMGB1蛋白含量差异无统计学意义；HTS组和HTS+NaHS组细胞质HMGB1蛋白含量增加(P<0.05)；与HTS组相比，HTS+NaHS组细胞质HMGB1蛋白含量减少(P<0.05)。 9．与SHAM组和SHAM+NaHS组相比，HTS组和HTS+NaHS组Survivin蛋白显著降低（P<0.05）；与HTS组相比，HTS+NaHS组Survivin蛋白的表达增加（P<0.05）。 10．与SHAM组和SHAM+NaHS组相比，HTS组和HTS+NaHS组Caspase-3与Bax蛋白表达明显增加(P<0.05)；与HTS组相比，HTS+NaHS组Caspase-3与Bax蛋白都有明显降低（P<0.05）。 结论： 1．外源性H2S能改善创伤失血性休克后的平均动脉压，降低心肌酶，保护心肌组织。 2．外源性H2S能抑制NF-κB信号转导通路，减轻创伤失血性休克导致的炎症反应。 3．外源性H2S能上调Survivin的表达，下调凋亡促进因子Caspase-3及Bax的表达，对创伤失血性休克导致的凋亡有改善作用。
创伤失血性休克;临床治疗;外源性硫化氢;疗效评价
第四军医大学
硕士
麻醉学
柴伟;高昌俊
2012
中文
R605.971
72
2012-11-02（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）