LPS诱导PC12细胞损伤的机制及EPA的防护作用研究
帕金森病是一种常见于老年人的慢性退行性疾病，其最具特征性的神经病理学变化是DA能神经元的进行性缺失和特征性的Lewy’s小体的形成。近年来对PD的实验研究取得了突破性的进展，但其确切机制仍然不明确。自1988年McGee等在PD患者的中脑黑质致密带(SNpc)中发现了激活的小胶质细胞后，以小胶质细胞激活为特征的神经免疫炎症机制开始受到关注。 小胶质细胞(microglia，MI)是中枢神经系统(centralnervessystem,CNS)内的主要免疫效应器，在脑内各部都有分布，尤以黑质分布最多。在炎症、缺血及中枢神经系统变性疾病中发挥作用。脂多糖是革兰阴性菌细胞壁的主要组成成分，是一种强烈的致炎因子。目前，关于LPS诱导的小胶质细胞活化的体内和体外实验开展的很多，但其确切的机制却仍然不清。 二十碳五烯酸(EicosapentaenoicAcid,EPA)，是n-3系多不饱和脂肪酸(n-3PUFAs)的一种，其天然来源是海洋动物。EPA有五个不饱和键和4个活泼的亚甲基，这使得EPA极易受光、热、金属元素及自由基的影响。许多研究发现，EPA具有抗炎、预防心血管疾病、降脂和抑制肿瘤生长等方面的作用，其中抗炎作用受到广泛关注，但其确切机制仍然不明确。 目的： 通过LPS直接作用于PC12细胞，观察LPS对PC12细胞的影响；建立PC12细胞与BV-2细胞共培养体系，观察LPS对PC12细胞的影响和对BV-2细胞的活化；观察EPA对LPS诱导的BV-2细胞活化的影响及其可能的机制。 方法： 1．通过体外培养PC12细胞，以不同浓度LPS(0.1μg/mL、0.25μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mL)作用24h，MTT法检测细胞活力、流式细胞术检测细胞凋亡、比色法测定培养基中LDH的含量、Western-blot检测细胞中TH的表达； 2．建立BV2细胞和PC12细胞共培养模型，以不同浓度LPS(0.1μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mL)作用24h，流式细胞术检测PC12细胞的凋亡、比色法测定培养基中LDH的含量、E-lisa检测培养基中TNF-α、IL-1β的含量、Western-blot检测细胞中TH的表达； 3．体外培养BV2细胞，以不同浓度LPS(0.1μg/mL、0.25μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mL)作用24h，观察BV-2细胞形态学的变化、免疫荧光染色观察细胞OX-42蛋白的表达、Western-blot检测NF-κBp65和I-κB蛋白的表达、E-lisa检测培养基中TNF-α、IL-1β的含量； 4．体外培养BV-2细胞，以不同浓度EPA(25μmol/L、50μmol/L和100μmol/L)作用1h，LPS(1μg/mL)处理24h后，Western-blot检测NF-κBp65和I-κB蛋白的表达、E-lisa检测培养基中TNF-α、IL-1β的含量； 结果： 1．LPS作用于PC12细胞时，对其凋亡、TH表达和LDH的释放都没有显著性影响； 2．LPS损伤了共培养体系中的PC12细胞，与对照组相比，培养液中LDH释放量显著增加(P<0.05)、凋亡率显著增高(P<0.05)、TH表达显著降低(P<0.05)； 3．LPS作用于BV-2细胞24h，同对照相比，免疫荧光染色OX-42显示荧光颗粒显著增多。细胞内NF-κBp65随着LPS浓度的增加表达增加，而I-κB则随着LPS浓度的增加表达降低，同对照组相比，0.5μg/mLLPS组和1μg/mLLPS组差异具有显著性(P<0.05)。培养基中TNF-α、IL-1β的浓度均随着LPS浓度的增加而浓度增高，同对照组相比，0.5μg/mLLPS组和1μg/mLLPS组差异具有显著性(P<0.05)； 4．EPA抑制BV-2细胞的活化：与LPS组相比，100μmol/LEPA组NF-κBp65的表达显著降低(P<0.05)，而I-κB的表达则显著增高(P<0.05)；50μmol/LEPA组和100μmol/LEPA组培养基中TNF-α、IL-1β分泌量显著减少(P<0.05)。 结论： 1．本实验条件下，LPS对体外培养的PC12细胞不产生直接的损伤作用； 2．LPS可通过NF-κB通路激活BV-2小胶质细胞，进而使其释放炎性因子来损伤PC12细胞； 3．EPA可通过抑制NF-κB通路对LPS诱导的BV-2细胞的活化产生抑制作用。
LPS诱导;PC12细胞损伤;比色法测定;二十碳五烯酸;免疫荧光染色
第四军医大学
硕士
营养与食品卫生学
王枫;季爱玲
2010
中文
R742.5
73
2012-11-02（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）