胰岛素样生长因子-Ⅰ对大鼠髁突软骨细胞调控的实验研究
目的：探讨胰岛素样生长因子-I（IGF-I）在出生后至青春前期大鼠髁突正常发育改建中的作用、表达分布及可能发挥作用的信号传导途径。
方法：1.分离、培养、鉴定出生后1d、7d、14d、28d SD大鼠髁突软骨细胞。 2.观察IGF-I、IGF-IR、Bcl-2及Bax在髁突软骨的分布及表达变化趋势（1）运用免疫组化技术检测IGF-I、IGF-I受体（IGF-IR）、抑凋亡蛋白Bcl-2、促凋亡蛋白Bax在出生后1d、7d、14d、28dSD大鼠髁突软骨的分布趋势，使用AxioVision Rel 4.7软件，在蛋白水平半定量分析IGF-I、IGF-IR、Bcl-2、Bax随年龄表达变化趋势。（2）运用real time PCR技术检测出生后1d、7d、14d、28dSD大鼠髁突软骨细胞内IGF-I、IGF-IR、Bcl-2及Bax mRNA随年龄表达变化趋势。 3.检测IGF-I 表达上调后，相关下游因子基因水平的量变在体外培养的髁突软骨细胞中加入重组rIGF-I后，运用real-time PCR技术检测以下因子mRNA表达的量变：（1）髁突软骨细胞表面相关受体(IGF-IR、IGF-ⅡR )；（2）Irs/PI3K/Akt通路下游基因Irs1、cyclinD1、PCNA、GSK-3以及Ras/Raf/MARK通路下游基因Raf1、C-Jun、NF-ΚB、IGFBP3；（3）凋亡相关因子：Bcl-2、Bax、caspase3；（4）可能与IGF-I相互作用的因子，如转化生长因子-β（Transforming growth factor-β，TGF-β)、整合素（integrin）、甲状旁腺相关蛋白（parathyroid hormone-related protein，PTHrP）及Ihh（Indian hedgehog）。
结果：1. P1～P2代及冻存复苏后第一代的髁突软骨细胞Ⅱ型胶原免疫组化染色阳性，体外单层培养的软骨细胞生长良好。2. IGF-I、IGF-IR、Bcl-2及Bax在髁突软骨的分布及表达变化趋势：（1）免疫组化染色显示IGF-I主要分布在增殖层，IGF-IR在增殖层至肥大软骨细胞浅层分布最明显，与Bcl-2、Bax分布部分重叠，蛋白半定量分析表明IGF-I、IGF-IR、 Bcl-2、Bax在出生后第7天时表达最高，此后呈下降趋势，且IGF-I在28天时表达明显上升（P<0.05）。（2）IGF-I mRNA的表达逐渐降低，至28天时表达开始增强；IGF-IR出生后稍有波动但表达相对平稳，至28天时开始下降；Bcl-2、Bax mRNA表达逐渐增强，至出生14天时表达开始下降。3．IGF-I表达上调后，相关下游因子基因水平的量变趋势：（1） IGF-IR mRNA整体呈下降趋势，28天时下降明显(P<0.05)，IGF-ⅡR mRNA表达水平总体呈上调趋势。（2）Irs/PI3K/Akt通路上Irs1与cyclinD1表达变化趋势一致，1d时表达上升，此后均下调，靶蛋白PCNA表达总体呈上升趋势，GSK-3表达下调；Ras/Raf/MARK通路下游靶基因NF-ΚB、IGFBP3表达上调，而Raf1与下游C-Jun表达变化趋势一致，均在7d时表达下降，其余时间点表达上升（P<0.05）。（3）凋亡相关因子：Bcl-2 mRNA在28天时表达显著增高，Bax表达下调，Bcl-2/Bax 基因水平比值增加，在28天时最为显著；caspase3表达略有上升，到28天时显著下调。（4）TGF-β、PTHrP表达上调，integrin、Ihh表达下调。
结论：1．体外单层培养的髁突软骨细胞，P1～P2代及冻存复苏后第一代的软骨细胞能保持良好的生物特性，可用于后续实验。2．IGF-I、IGF-IR、Bcl-2及Bax在出生后发育中的髁突软骨内均有表达，且Bcl-2 、Bax为IGF-I下游靶蛋白，推测IGF-I/IGF-IR/Bcl-2、Bax信号途径参与了髁突软骨增殖与凋亡的调控。3．IGF-I通过Irs/PI3K/Akt及Ras/Raf/MAPK介导的信号转导机制参与了髁突软骨细胞的增殖、分化以及软骨形成早期的调控。此外，IGF-I可能与其他蛋白（TGF-β、integrin、PTHrP、Ihh）相互作用，共同参与髁突发育的过程。
胰岛素样生长因子-Ⅰ;髁状突软骨细胞;凋亡相关因子;髁突软骨发育;信号通路;转导机制
上海交通大学
硕士
口腔临床医学
高益鸣
2011
中文
R782.23;R329.2
30
2012-11-08（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）