叶酸受体靶向磁共振/荧光多功能脂质体的研究
叶酸受体是一种与糖基化磷脂酰肌醇（glycosylp-hosphatidylinositol，GPI）连接的膜糖蛋白，对叶酸有高度亲和性。在多数肿瘤细胞中，叶酸受体高度表达，而在多数正常细胞中，叶酸受体不表达。因此，可将叶酸受体作为肿瘤标志物，设计叶酸偶联物，靶向叶酸受体。脂质体是一种生物相容性好的载药系统，便于携带药物或者诊断试剂。因此可以将叶酸配体连接到脂质体上，形成肿瘤靶向的脂质体。
磁共振成像技术具有空间定位能力好的特点，但灵敏度不够高。荧光成像的灵敏度很高，但难以在组织中深层定位，因而将这两种方法结合起来，不仅可以更灵敏、精确的定位肿瘤，而且可以实现手术前用磁共振成像定位肿瘤，术中在荧光指导下行切除术的构想。本文利用脂质体作为生物相容的给药系统，将叶酸配合物作为靶向基团，同时包封MRI造影剂Gd-DTPA-bis(SA)和荧光染料Calcein，制备叶酸受体靶向的磁共振成像、荧光成像多功能脂质体。
1.Gd-DTPA-bis(SA)的合成以DTPA为起始原料，制备出DTPA环酸酐cDTPAA。再用十八胺氨解酸酐制备酰胺DTPA-bis(SA)，最后再在DTPA-bis(SA)上螯合Gd3+得到Gd-DTPA-bis(SA)。本文也制备了Gd-DTPA作为Gd-DTPA-bis(SA)的对照。两种产物经过红外图谱、紫外图谱的确证，并通过ICP-AES测得化合物中Gd的含量，其中Gd-DTPA-bis(SA)含Gd量为13.3％，与理论值14.9％较接近，Gd-DTPA含Gd量为26.1％，与理论值27.4％较接近。Gd-DTPA-bis(SA)的DSC图谱显示，其相变温度为65.32℃，相变和磷脂类似，可以与脂质材料一起成膜制备脂质体。
2．叶酸靶向磁共振/荧光多功能脂质体的制备及表征通过薄膜分散法制备脂质体，用Gd-DTPA-bis(SA)、叶酸受体配体Folate-PEG3350-CHEMS，及HSPC，mPEG2000-DSPE，Cholesterol成膜，荧光染料Calcein溶液作为水化液。文中考察了Folate-PEG3350-CHEMS的投料量，通过细胞摄取实验，确定其含量占总脂质的摩尔量1％时，Hela细胞的特异性吸附及游离叶酸阻断实验结果明显。文中也考察了Gd-DTPA-bis(SA)的投料量，认为其含量占总脂质的摩尔量25％时，脂质体稳定而且磁共振成像清晰。同时也考察了乙醇注入法制备脂质体、脂质材料的总投料量、水化液的水化体积、Calcein水化液的配制方法等因素对脂质体稳定性的影响。
所制备出的脂质体通过激光动态光散射技术考察其粒径、电位，测得粒径为125nm~150nm，而且4℃放置三个月后，脂质不沉降，粒径基本没有变化。采用荧光分光光度计考察脂质体的荧光光谱学特性，发现脂质体的包裹没有引起Calcein的发射波长的改变。Calcein在一定浓度范围内，紫外吸光度和浓度呈线性关系，从而测得脂质体破膜后Calcein的含量，计算Calcein的包封率。得出Calcein包封率低，1.2~4.7％，这是由于Calcein水溶性好、分子量很小，易于从脂质体中渗漏。采用ICP-AES测脂质体含Gd的量，计算得出Gd的包封率较高。对磁共振/荧光脂质进行T1加权成像，可以观察到脂质体明亮的磁共振信号，而且随着脂质体浓度的降低，磁共振信号逐渐减弱。
3.荧光法和磁共振法考察体外细胞对脂质体的摄取荧光法考察体外细胞对脂质体的摄取
3.1.1 流式细胞术考察KB细胞对不含Gd、含Calcein的荧光脂质体的摄取
将KB细胞与Calcein终浓度为3.3μM的Calcein-L、F-Calcein-L及F-Calcein-L+FA共培养1h后洗去药液，于流式细胞仪上检测。F-Calcein-L组的平均荧光强度是Calcein-L组的163倍，是加游离叶酸干预组的6.8倍。
3.1.2 荧光显微镜定性观察KB细胞对含Gd、含Calcein的磁共振/荧光脂质体的摄取
将KB细胞与Calcein终浓度为15.2μM的Gd-Calcein-L、F-Gd-Calcein-L及F-Gd-Calcein-L+FA共培养1h后洗去药液，细胞在PBS中，使用荧光倒置显微镜观察。KB细胞与含叶酸配体的脂质体共培养后可以观察到明亮的绿色荧光，而没有偶联叶酸配体的脂质体几乎没有荧光。当在F-Gd-Calcein-L中加入游离叶酸后，可以看到细胞内的绿色荧光明显减弱。而且，从荧光照片上可以看到细胞的荧光主要集中在细胞膜上，由于叶酸受体是一种膜糖蛋白，而脂质体进入细胞是经过叶酸受体介导的内吞作用，所以细胞的荧光集中在膜上。
3.1.3 流式细胞术考察KB细胞、Hela细胞、A549细胞对含Gd、含Calcein磁共振/荧光脂质体的摄取
将叶酸受体表达阳性的KB细胞与Calcein终浓度为12.5μM或5.8μM的Gd-Calcein-L、F-Gd-Calcein-L及F-Gd-Calcein-L+FA共培养1h后洗去药液（用了两种方法：六孔板法和Ep管法），于流式细胞仪上检测。F-Gd-Calcein-L组的平均荧光强度是Gd-Calcein-L组的几十甚至上百倍，是加游离叶酸干预组的10-31倍。
将叶酸受体表达阳性的Hela细胞与Calcein终浓度为12.5μM的Gd-Calcein-L、F-Gd-Calcein-L及F-Gd-Calcein-L+FA共培养1h后洗去药液，于流式细胞仪上检测。F-Gd-Calcein-L组的平均荧光强度是Gd-Calcein-L组的33倍，是加游离叶酸干预组的17倍。
将叶酸受体表达阴性的A549细胞与Calcein终浓度为5.8μM的Gd-Calcein-L、F-Gd-Calcein-L及F-Gd-Calcein-L+FA共培养1h后洗去药液，于流式细胞仪上检测。F-Gd-Calcein-L组的平均荧光强度和Gd-Calcein-L组，加游离叶酸干预组的平均荧光强度基本一致，没有特异性的摄取作用。
以上荧光实验可以看出：叶酸靶向的脂质体可以与叶酸受体表达阳性的KB细胞、Hela细胞特异性作用，并且这种作用可以被游离叶酸竞争性拮抗。对叶酸受体低表达的A549细胞，叶酸靶向的脂质体没有特异的作用。
3.2 磁共振成像法考察细胞对脂质体的摄取
3.2.1 磁共振成像定性考察Hela细胞对含Gd、不含Calcein的磁共振脂质体的摄取
将叶酸受体表达阳性的Hela细胞与Gd-L、F-Gd-L及F-Gd-L+FA共培养2.5h后洗去药液，于3.0T磁共振成像仪上检测。F-Gd-L组的磁共振成像信号比Gd-L组强，且加游离叶酸干预后，信号减弱。
3.2.2 磁共振成像定性考察Hela细胞、KB细胞对含Gd、含Calcein的磁共振/荧光脂质体的摄取
将叶酸受体表达阳性的Hela细胞与空白脂质体、Gd-Calcein-L、F-Gd-Calcein-L、F-Gd-Calcein-L+FA、Gd-DTPA共培养1h后洗去药液，于3.0T磁共振成像仪上检测。F-Gd-Calcein-L组的磁共振成像信号比Gd-Calcein-L组强，且加游离叶酸干预后，信号减弱。而且细胞孵育后，F-Gd-Calcein-L比Gd-DTPA磁共振信号强。说明脂质体包裹的Gd造影剂释放缓慢、滞留时间延长。
将叶酸受体表达阳性的KB细胞与Gd-Calcein-L、F-Gd-Calcein-L及F-Gd-Calcein-L+FA共培养1h后洗去药液，于3.0T磁共振成像仪上检测。F-Gd-Calcein-L组的磁共振成像信号比Gd-Calcein-L组强，且加游离叶酸干预后，信号减弱。
磁共振成像实验同样可以说明：叶酸靶向的脂质体可以与叶酸受体表达阳性的KB细胞、Hela细胞特异性作用，并且这种作用可以被游离叶酸竞争性拮抗。
叶酸靶向的脂质体粒径较小，稳定性好。包裹水溶性荧光染料Calcein，不影响其最大发射波长；包裹磁共振造影剂Gd-DTPA-bis(SA)，脂质体磁共振成像清晰。插入叶酸配体后，脂质体能靶向到叶酸受体表达阳性的细胞，并且这种作用可以被游离叶酸阻断，但是对于叶酸受体表达阴性的细胞，这种特异性作用并不存在。因此该脂质体可以作为模型药物，为进一步探索肿瘤靶向的磁共振/荧光多功能探针作铺垫。
脂质体;磁共振成像;叶酸受体;生物相容性;载药系统;肿瘤靶向探针
华中科技大学
硕士
药物化学
项光亚
2010
中文
R445.2;TQ460.4
2012-04-26（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）