γ-谷氨酰转肽酶酶学性质及其催化应用研究
γ-谷氨酰转肽酶在生物体内广泛存在，是谷胱甘肽代谢的关键酶之一，随着生物技术发展的快速发展，利用?-谷氨酰转肽酶制备系列γ-谷氨酰基类化合物的研究已成为生物催化领域的热点。目前，本实验室筛选到一株γ-谷氨酰转肽酶高产菌株，并已探索了以菌体作为酶源催化合成茶氨酸的生产工艺。在此基础上，我们作了进一步的研究。
目的：
以Bacillus licheniformis C12菌株为γ-谷氨酰转肽酶制备的菌种来源，通过对其产酶发酵条件优化、提取工艺、酶学性质及固定化该酶催化底物生产茶氨酸进行系统研究，为固定化该酶工业化生产茶氨酸打下基础。
方法：
1.产酶发酵的诱导条件研究：采用底物诱导作用，通过不同底物（甘氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺）对菌体产酶发酵进行诱导，提高菌体的产酶量。
2.酶的提取及酶学性质研究：采用溶菌酶法、反复冻融法、超声波法破碎细胞壁，高速冷冻离心后获得?-谷氨酰转肽酶粗酶液，经硫酸铵分级沉淀及透析脱盐初步纯化后，得到酶的提取物。采用?-谷氨酰转肽酶常规测定方法检测其酶学性质。
3.固定化酶制备及催化条件研究：采用海藻酸钠包埋戊二醛交联法，制备固定化酶，通过正交试验对固定化酶条件进行优化。通过采取调整底物浓度、反应温度、pH 以及添加酶促进剂提高固定化酶催化生产茶氨酸量，并采用正交试验得到最佳的固定化酶催化生产茶氨酸的工艺条件。
结果：
1.产酶发酵的诱导条件研究：产酶发酵24h后添加谷氨酰胺至浓度5mmol/L，诱导2h后，其酶活力最高为7.0U/ml，是对照组的2.26倍。
2.酶提取及酶学性质研究：菌体细胞破碎的较佳方法为溶菌酶破碎法，其操作条件选择为每克湿菌体加入2.5mg溶菌酶，35 ℃酶解20min，冷冻离心得粗酶液。再经过80-90％饱和度的硫酸铵分级沉淀及透析脱盐初步纯化后，得到酶的提取物。该酶的最适pH为8.0，最适温度为45 ℃，?-谷氨酰转肽酶的转肽反应Km为0.73mmol/L。
该酶在25-35 ℃的温度范围有较好的稳定性，在50℃的温度下保存20min 酶活力基本丧失。该酶在碱性环境中比较稳定，酸性环境中很容易失活。在Ba 2+，Mg 2+，Ca 2+等金属离子浓度为5mmol/L的情况下，对该酶的活力均有促进作用。
3.固定化酶制备及催化条件研究：①固定化酶制备方法：采用海藻酸钠包埋戊二醛交联法，取一定量的酶提取物，添加含量3.0％的海藻酸钠包埋，再添加0.25％戊二醛进行交联，交联时间2.5h。制备得到的固定化酶酶活回收率为70.8％。固定化酶的最适pH为9.0，与游离酶相比向酸性方向偏移1.0个单位；固定化酶的最适温度为37 ℃，比游离酶最适温度降低了8 ℃。γ-谷氨酰转肽酶经固定化后，热稳定性、酸碱稳定性和贮存稳定性都得到了提高。②固定化酶催化条件：研究了Mg 2+及1,6-二磷酸果糖（FDP）发酵液在转化体系中促进合成茶氨酸的作用，通过正交试验确定Mg 2+及1,6-二磷酸果糖（FDP）发酵液在转化体系中促进合成茶氨酸的较佳条件为2.0mlFDP 发酵液/30ml 转化液以及Mg 2+浓度为3.0mmol/L。在此条件下固定化酶转化合成茶氨酸量为9.5g/L，相比对照组6.1g/L 提高了55.7％。固定化酶生产茶氨酸的操作稳定性比较差，反应九批次后，茶氨酸产量只有首批次的31.1％。
结论：
本研究优化了产酶发酵条件，初步建立了来源于Bacillus licheniformis C12菌株的γ-谷氨酰转肽酶的提取纯化方法及了解了该酶的部分酶学性质。采用海藻酸钠包埋戊二醛交联法，制备固定化?-谷氨酰转肽酶，可用于生产茶氨酸。固定化酶酶活力与操作稳定性还有待进一步提高。
γ-谷氨酰转肽酶;酶学性质;固定化酶;茶氨酸
广东药学院
硕士
病原生物学
胡立勇
2011
中文
Q555
2011-11-30（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）