茶枝柑皮多糖提取、分离纯化、结构及抗氧化活性研究
茶枝柑皮是茶枝柑（Citrus reticulata ‘Chachi’）的成熟果皮，果皮晒干陈化后，便成了广东道地药材——广陈皮。茶枝柑皮主要是药用（作为广陈皮）、制成调味品及凉果，除了含有挥发油、黄酮外，茶枝柑皮还含有丰富的果胶多糖，历来对茶枝柑皮未进行深加工，造成资源的浪费。本论文以茶枝柑皮为原料，利用现代分离分析手段，对茶枝柑皮果胶多糖的提取、纯化工艺、单糖组成的测定方法、化学结构及其体外抗氧化活性进行了较系统的研究，以期为茶枝柑资源的开发利用提供科学依据和利用途径。
1.采用酸水提醇沉法提取茶枝柑皮粗多糖（CCP）。单因素试验确定各因素（提取溶剂pH值、料液比、提取温度和时间）对多糖得率和抗氧化能力影响的合适水平，并用正交试验进一步优化。经试验得出CCP的最佳提取工艺为：用pH4的酸水、料液比为1：30、提取温度90℃、提取时间90min，在此条件下多糖得率和抗氧化FRAP值分别为18.9％和48.9。粗提多糖膨胀力和持水力均较高，并属于高酯果胶多糖。
2.将CCP通过树脂脱色和Sevag试剂去除蛋白，得到纯化的多糖CP。通过静态吸附法，考察了大孔吸附树脂、离子交换树脂对CCP溶液的脱色率，由于D-201阴离子交换树脂脱色效果优于其它树脂，故选择D-201树脂作为CCP的脱色树脂，并进一步研究了D-201树脂的最佳脱色工艺：脱色温度40℃，树脂用量8％（m/v），转速75r/min振荡2h。Sevag法除蛋白则需在反复萃取6～9次后，达到蛋白去除率为74％。
3.采用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）作为还原醛糖的标识分子，柱前衍生化高效液相色谱-紫外检测器（HPLC-UV）和普通C18柱，建立了8种常见单糖的快速分析鉴别技术，并且确定了单糖的衍生化条件及多糖CP的水解条件。CP用2 mol/L的三氟乙酸（TFA）在120℃烘箱中水解2h得到各单糖，单糖在70℃下与PMP衍生化反应40min后用1：1（v/v）氯仿涡旋萃取3次。流动相20％（v/v）乙腈-磷酸盐缓冲溶液（pH 7.1）、流速1.0mL/min、等度洗脱即可实现单糖的良好分离。方法学考察结果表明，各单糖的相关系数、精密度、重复性、回收率均良好。
4.对纯化后的茶枝柑皮多糖CP采用DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析进行分离得到4个组分，分别命名为CPN、CPA-1、CPA-2、CPA-3，将CPA-1、CPA-2、CPA-3进一步用Sephadex G-100凝胶排阻层析纯化得到对应的CPA-Ⅰ、CPA-Ⅱ、CPA-Ⅲ。经TSK G-5000PW xL、TSK G-3000PW xL 柱高效凝胶色谱分析，证实CPA-Ⅰ、CPA-Ⅱ、CPA-Ⅲ具有较高的纯度，其重均分子量分别为8.0×104 Da、2.6×105Da、2.4×105Da。红外光谱结果表明，CPN是带有结晶水的吡喃多糖，CPA-Ⅰ、CPA-Ⅱ和CPA-Ⅲ均是部分羧酸甲酯化的α-半乳糖醛酸多聚糖。NMR结果推测茶枝柑皮多糖主链是由(1→4)-α-GalpA构成，存在部分半乳糖醛酸甲酯化，半乳糖、鼠李糖、甘露糖等以α-吡喃糖形式存在于末端或侧链。
单糖组成分析表明，CPN中单糖的摩尔比是Man：Rha：GalA：Glc：Gal：Xyl：Ara=0.34：0.07：5.30:1:4.71:0.61:14.7；CPA-Ⅰ的单糖摩尔比是Man：Rib：Rha：GalA：Glc：Gal：Ara=0.12：0.04：0.74：39.33：1：8.48：24.05；CPA-Ⅱ的单糖摩尔比是Man：Rib：Rha：GalA：Glc：Gal：Ara=0.94：0.05：1.33：56.65：1：7.04：19.38；CPA-Ⅲ的单糖摩尔比是Man：Rha：GalA：Glc：Gal：Ara=2.02：1.98：122.66：1：8.85：26.26。
5.通过体外模拟试验，采用MTT法首先筛选了H2O2致U251细胞损伤的最佳成模浓度，是0.1875mmol/L；再研究了茶枝柑皮粗多糖（CCP）对过氧化氢损伤的U251细胞的保护作用，在试验浓度2.500-0.078mg/mL范围内呈剂量依赖关系；CCP脱蛋白后的多糖则未表现出抗氧化活性。
茶枝柑皮多糖;提取;纯化;柱前衍生高效液相色谱;结构分析;抗氧活性
广东药学院
硕士
药物分析学
黄庆华
2011
中文
R284.2
2011-11-30（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）