促红细胞生成素对大鼠胰腺腺泡细胞和肺组织的保护作用
【目的】 探索原代培养胰腺腺泡细胞方法并鉴定所培养细胞的性质，为急性胰腺炎(acute pancreatitis, AP)体外模型的构建创造条件，通过促红细胞生成素(Erythropoietin，EPO)对胰腺腺泡细胞和肺组织保护作用的研究，为今后EPO治疗AP的临床应用提供理论依据。
【方法】分离提纯胰腺腺泡细胞，将其置于DMEM-F12培养液中培养，24h后电子显微镜下观察胰腺腺泡细胞的超微结构变化，并运用PaA抗体鉴定培养细胞性质。90只Sprague-Dawley(SD)大鼠分为假手术组(sham-operation group, SO)，SAP(Severe acute pancreatitis, SAP)组，EPO1000组，EPO3000组，EPO5000组，每组18只，分别按以下时间24h、48h、72h随机处死6只。逆行胰胆管注射5％牛磺胆酸钠(sodium taurocholate, STC)（0.1ml/100g)制备SAP大鼠模型。测大鼠肺、胰腺干湿比重及体重系数，人工碘比色法测血清AMS，Elisa试剂盒测IL-1、IL-6和TNF-α，分析3种炎性因子的相互关系；HE染色观察胰腺和肺组织病理变化，免疫组化法检测胰腺组织中EPOR的表达，Elisa法检测EPOR表达水平。
【结果】 ①新鲜分离的大鼠胰腺腺泡细胞悬浮在培养液中，形态不规则，细胞质与细胞核比例较大。分离纯化后腺泡细胞绝大多数呈圆形或椭圆形，细胞核呈圆形，偏于一侧，细胞间杂质较少。②24h后可见细胞数有所增加，细胞明显聚集，2～3天换液后观察细胞，细胞活性好，细胞数目明显增多，传代良好。③经台盼蓝染色测定细胞活性达96％以上，符合进一步实验要求。④电镜下，大量的酶原颗粒位于细胞顶部的胞质内，细胞内可见发达的粗面内质网，在酶原颗粒聚集的区域可见高尔基复合体。⑤经PaA抗体检测腺泡细胞在免疫荧光镜下呈现大片绿色荧光。⑥SAP组大鼠肺脏干湿比重大于SO组 (P<0.05)，经EPO治疗后，肺、胰腺水肿减轻；SAP组大鼠体重系数亦大于SO组和EPO组(P<0.05)；⑦SAP组与EPO组血清AMS、IL-1、IL-6、TNF-α水平均明显高于SO组，经EPO治疗24h和48h后，测血清AMS明显降低（P<0.05），SAP组和EPO组各时间点的血清炎症因子(IL-1、IL-6、TNF-α)含量均高于SO组, SAP组升高显著，48h达到峰值，72h有所回落，经EPO治疗后各指标均有下降，EPO疗效呈时间依赖性，三者之间呈正相关性(r=0.534, p=0.02; r=0.584, p=0.04; r=0.820，p=0.00)，有相互促进表达作用。⑧SO组胰腺和肺组织均无明显病理变化；SAP组大鼠胰腺和肺组织出现不同程度水肿、渗出、炎症细胞浸润，部分组织出现出血、坏死、空泡形成，细胞间结构模糊，甚至连接成片；EPO治疗组胰腺和肺组织病理损伤程度明显改善，病理评分显著低于SAP组（P<0.05）。组间比较显示：除EPO3000和EPO5000间无统计学意义外，其他各组间差异均有统计学意义。⑨EPO治疗组、假手术组大鼠胰腺和肺组织中，可见散在的EPOR阳性表达，染色位置位于胞浆；不同剂量EPO治疗组中EPOR在胰腺和肺组织中均呈现大片深染的阳性表达。⑩ELISA法测EPOR表达量示：假手术组、SAP组EPO1000组中EPOR表达量的变化不显著，差异无统计学意义，EPOR表达量随EPO剂量的增加而增加。
【结论】 ①本实验方法可成功原代培养胰腺腺泡细胞，培养细胞纯度及存活率高，符合体外实验要求；②PaA抗体可成为鉴定胰腺腺泡细胞的一种便捷、可行的方法，其特异性高，可推广应用于鉴定胰腺腺泡细胞；③SAP组大鼠血清中炎症介质IL-1、IL-6、TNF-α水平呈逐渐升高趋势；EPO可有效减轻胰腺和肺组织病理损伤，降低SAP大鼠血清AMS、IL-1、IL-6、TNF-α水平；④ELISA法及免疫组化法检测出胰腺腺泡细胞上EPOR的表达，其表达量随EPO剂量的增加而增加，但与治疗时间无明显相关性，由此推测EPO可与EPOR结合后，激活下游的细胞信号转导通路，从而起到抗炎的作用。
腺泡细胞;原代培养;鉴定;促红细胞生成素;急性胰腺炎;保护作用
广东药学院
硕士
临床医学(内科学)
陈垦
2011
中文
R576
2011-11-30（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）