异氟烷对发育期海马神经元钙振荡及轴突生长分化的影响
研究背景:
异氟烷是一种广泛应用于临床的吸入麻醉药，虽然其具体作用机制还有待于进一步研究，目前普遍认为其主要通过激活（或增强）中枢神经系统内的γ-氨基丁酸A（GABAA）受体和甘氨酸（gly）受体的功能发挥作用。发育期神经系统正处于神经发生与突触形成的高峰时期，在此期间神经系统的生长分化易受到各种干扰因素的影响。由于全身麻醉药物以中枢神经系统作为其作用靶器官，因而近年来全身麻醉药对发育期神经系统的生长发育是否存在毒性作用正逐渐引起广泛关注。
Γ-氨基丁酸（GABA）是脑内最重要的抑制性神经递质之一，可分为GABAA、GABAB、GABAC等三种受体亚型。GABAA受体广泛分布于大脑皮层、丘脑内外侧膝状体、海马、杏仁、丘脑、黑质、导水管周围黑质和小脑，是一种配体门控的氯离子通道受体，主要介导突触后抑制从而发挥抗焦虑、镇静和抗惊厥作用。GABAA受体在出生时即有表达并具备功能，而GABAB、GABAC受体则在出生后7-14天才逐渐发育并具备功能。GABAA受体被激动后，由其门控的氯离子通道开放，其通道内Cl-流动的方向取决于细胞内外的Cl-浓度差。在中枢神经系统生长发育高峰期（胚胎晚期至出生后2周），未成熟神经元胞膜上Na+-K+-2Cl-同向转运体NKCC1高度表达，随后表达逐渐降低，NKCC1可将一个Na+、一个K+和2Cl-转运入细胞内，造成神经元胞浆内Cl-浓度增加。而K+-Cl-同向转运体KCC2在此期间表达低，随着神经元的发育成熟表达明显增加。KCC2逆Cl-电化学梯度将K+-Cl-同向转运出细胞，致使成熟神经元内Cl-浓度逐渐降低。成熟神经元表达具有功能的AMPA受体，AMPA受体兴奋可以移开阻滞于NMDA受体上的Mg2+，从而使NMDA受体Ca2+通道开放而兴奋。而未成熟神经元胞膜上缺乏具有功能的AMPA受体，其胞膜表达的GABAA受体兴奋可使Cl-外流，细胞膜去极化，从而发挥与成熟神经元上AMPA受体功能相似的作用，使Mg2+从阻滞于NMDA受体的位置移开，致NMDA受体兴奋。因而与成熟神经元不同，在胚胎期和出生后早期，GABAA受体介导突触后兴奋效应，在神经元轴突的生长、神经元之间突触的形成以及神经元的可塑性方面起着十分重要的作用。
海马的神经元环路通过长时程增强或长时程抑制表现出很强的可塑性，从而在学习和记忆的形成过程中发挥十分重要的作用。神经元环路的形成依赖于海马神经元神经突起的发育及神经元之间突触的形成。海马神经元存在自发的特异性的钙振荡，此种本能的特异性的钙振荡对发育期神经元神经突生长锥的迁移、神经突的生长分化、神经元之间突触联系的形成等都起着十分重要的作用。神经元胞体的钙振荡机制十分复杂。研究表明，钙振荡由细胞外的钙离子通过配体调控性钙通道（如NMDA受体）或者电压调控性钙通道（如L型钙通道）进入胞浆，诱导内质网释放钙离子使胞浆内钙离子浓度急剧短暂升高，而胞浆内升高的钙离子被位于内质网上的Ca2+-ATP酶等迅速吸收，或被位于胞浆膜上的Na+/Ca2+交换子或钙泵泵出胞浆，从而使胞浆钙离子浓度恢复正常水平。神经元钙振荡的振幅和频率与轴突的生长锥的移行速度呈负相关。生长锥移行的物质基础是细胞骨架的重建，而胞浆Ca2+浓度短暂而瞬间的增加对细胞骨架的重建起着十分重要的作用。生长锥暂停移行时可以形成大的微管环，当微管环碎裂展开时生长锥重新开始移行。生长锥重新启动生长移行需要动力微管和肌动蛋白丝之间相互作用。胞浆内的钙振荡通过作用于神经钙蛋白使肌动蛋白丝脱聚合化以保持微管环的稳定，从而抑制生长锥的移行。研究证实，使用L-型Ca2+通道阻滞剂消除神经元的钙振荡，可促进神经元轴突生长锥的生长移行；而增强钙振荡的振幅和频率则可减慢生长锥的移行速率。
因此本研究拟通过离体培养原代海马神经元，从影响神经元钙振荡、神经元存活、神经元轴突生长分化等方面深入探讨吸入麻醉药异氟烷致发育期海马神经元的神经毒性。本研究检验了以下假说：⑴异氟烷可增强发育期海马神经元的钙振荡；⑵临床安全浓度的异氟烷在安全时间内使用并不导致发育期海马神经元凋亡；⑶临床安全浓度的异氟烷通过增强海马神经元的钙振荡抑制神经元轴突生长锥的移行。
统计学分析:
计量资料以均数±标准差（`x±s）表示，采用SPSS 12.0软件进行数据处理，钙荧光强度、MTT比色实验中的细胞存活率、活化Caspase-3的表达、神经元轴突的生长等采用配对t检验，其余结果比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。
研究总结一、主要研究结果1． 通过应用二次顶空气相色谱法（GC）测定培养基内异氟烷浓度以构建离体培养原代海马神经元的异氟烷干预模型。
2． 通过离体原代海马神经元培养，使用胞浆内钙离子荧光染色剂Fluo-4 AM在激光共聚焦显微镜下观测其钙振荡变化，并分析其特点及机制，证实吸入麻醉药异氟烷通过兴奋GABAA受体而增强发育期海马神经元的钙振荡。
3． 通过研究临床相关浓度异氟烷对发育期大鼠海马神经元轴突生长分化的影响，证实临床浓度的异氟烷并不导致海马神经元凋亡，但可抑制轴突的生长分化。
二、研究结论
临床浓度的吸入麻醉药异氟烷通过兴奋GABAA受体增强发育期海马神经元的钙振荡，从而抑制海马神经元轴突的生长分化。
异氟烷;钙振荡;凋亡;生长锥;海马神经元;GABAA受体
华中科技大学
博士
麻醉学
罗爱林
2010
中文
R971.2
2011-11-30（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）