钠氢交换体1在内毒素性急性肺损伤中作用的实验研究
第一部分 钠氢交换体1在大鼠内毒素性急性肺损伤中的表达
目的：建立大鼠内毒素性急性肺损伤实验模型，观察实验模型中大鼠肺组织上钠氢交换体1的表达变化情况及其与炎症的关系。
方法：40只雄性清洁级SD大鼠，体重在250～350g之间，随机分成空白对照组（C组）、脂多糖2h组（L-2h组）、脂多糖4h组（L-4h组）和脂多糖6h组（L-6h组），每组各10只。C组大鼠给予股静脉输注生理盐水；L-2h组、L-4h组和L-6h组大鼠均给予股静脉输注6mg/kg 脂多糖。实验开始后2 h 颈动脉放血处死C组和L-2h组大鼠, 4小时和6小时后分别处死L-4h组和L-6h组大鼠。监测各组大鼠基本生命体征；光学显微镜下观察大鼠肺组织病理改变；计算急性肺损伤评分和肺组织湿/干重比值；检测支气管肺泡灌洗液中总蛋白、肿瘤坏死因子-α和巨噬细胞炎性蛋白的浓度；测定肺组织髓过氧化物酶活性；EMSA检测肺组织细胞核转录因子-Κb的活性；免疫组化、RT-PCR和Western Blot检测肺组织钠氢交换体1Mrna和蛋白的表达水平。
结果：（1）和空白对照组比较，脂多糖各组大鼠平均动脉压明显下降（均P＜0.05）、心率和呼吸频率明显上升（均P＜0.05）；脂多糖4h组和6h组大鼠动脉血氧分压显著下降（均P＜0.05），（2）空白对照组大鼠肺组织肺泡结构正常，肺泡腔无渗出物；脂多糖各组大鼠肺组织病理改变明显，肺泡间隔增厚，肺泡腔内可见较多的炎性细胞，肺泡腔内有血性渗出液。和空白对照组比较，脂多糖各组大鼠肺组织急性肺损伤评分均明显增高（P＜0.05）。（3）和空白对照组比较，脂多糖各组大鼠肺组织湿/干重比均明显上升（P＜0.05）；支气管肺泡灌洗液中总蛋白、肿瘤坏死因子-α和巨噬细胞炎性蛋白的浓度均明显增高（均P＜0.05）。（4）和空白对照组比较，脂多糖各组大鼠肺组织髓过氧化物酶活性均明显增高（P＜0.05）。（5）和空白对照组比较，脂多糖各组大鼠肺组织核转录因子-Κb的活性均明显增高（P＜0.05）。（6）和空白对照组比较，免疫组化检测脂多糖各组大鼠肺组织NHE1的表达水平均明显增高（P＜0.05）。（7）和空白对照组比较，脂多糖各组大鼠肺组织钠氢交换体1Mrna的表达水平均明显增高（P＜0.05）。（8）和空白对照组比较，脂多糖各组大鼠肺组织钠氢交换体1的蛋白表达水平均明显增高（P＜0.05）。
结论：以6mg/kg的剂量给予大鼠静脉注射脂多糖后4h就产生了明显的急性肺损伤，表现为大鼠基本生命体征的内毒素休克症状出现；大鼠大体标本组织学炎症病理改变；肺组织含水量增加；肺组织及支气管肺泡灌洗液中相关炎性因子增加；与此同时，脂多糖各组大鼠肺组织钠氢交换体1Mrna和蛋白的表达水平也随着急性肺损伤炎症反应的加重而明显增加。
第二部分 阿米洛利对大鼠内毒素性急性肺损伤的保护作用
目的：探讨阿米洛利预先给药对脂多糖诱导的大鼠内毒素性急性肺损伤的保护作用及可能机制。
方法：40只雄性清洁级SD大鼠，体重在250～350g之间，随机分成空白对照组（C组）、脂多糖组（L组）、阿米洛利组(A组)和阿米洛利预给药组(AL组)。C组静脉输注生理盐水3ml；L组依次静脉输注1ml生理盐水及2ml脂多糖；A组依次静脉输注1ml阿米洛利及2ml生理盐水；AL组先输注1ml阿米洛利再输注2ml脂多糖。静脉注射脂多糖/阿米洛利6小时后颈动脉放血处死大鼠。光学显微镜下观察大鼠肺组织病理改变；计算急性肺损伤评分和肺组织湿/干重比值；测定支气管肺泡灌洗液中总蛋白的浓度；检测肺组织髓过氧化物酶活性、丙二醛浓度和超氧化物歧化酶活力；半定量免疫组化法检测肺组织过氧亚硝酸盐硝基酪氨酸残基的含量；RT-PCR检测肺组织钠氢交换体1Mrna的表达水平；Western blot法检测钠氢交换体1、细胞外信号调节激酶及p38丝裂原活化蛋白激酶的蛋白表达水平。
结论：大鼠静脉注射脂多糖产生急性肺损伤的同时伴随有肺组织钠氢交换体1、细胞外信号调节激酶及 p38丝裂原活化蛋白激酶的显著激活；钠氢交换体1抑制剂阿米洛利预先给药对大鼠内毒素性急性肺损伤有保护作用，其机制可能与抑制细胞外信号调节激酶的激活有关。
第三部分丝裂原活化蛋白激酶家族在阿米洛利防治大鼠内毒素性急性肺损伤中的作用
目的：探讨丝裂原活化蛋白激酶家族在阿米洛利预先给药防治脂多糖诱导的大鼠内毒素性急性肺损伤中的作用及可能机制。
方法：70只雄性清洁级SD大鼠，体重在250～350g之间，随机均分成空白对照组（C组）、脂多糖组（L组）、阿米洛利预给药组(AL组)、PD098059预给药组(PL组)、SB203580预给药组(SL组)、 阿米洛利联合PD098059预给药组(APL组)和阿米洛利联合SB203580预给药组(ASL组)。 C组静脉输注生理盐水3ml；L组静脉输注脂多糖(6mg/kg)及生理盐水总容积共3ml；AL组先静脉输注阿米洛利(10mg/kg)再输注脂多糖(6mg/kg)及生理盐水总容积共3ml；PL组先静脉输注PD098059(0.3mg/kg)再输注脂多糖(6mg/kg)及生理盐水总容积共3ml；SL组先静脉输注SB203580(10mg/kg)再输注脂多糖(6mg/kg)及生理盐水总容积共3ml；APL组先静脉输注阿米洛利(10mg/kg)再输注PD098059(0.3mg/kg)及脂多糖(6mg/kg)总容积共3ml；ASL组先静脉输注阿米洛利(10mg/kg)再输注SB203580(10mg/kg)及脂多糖(6mg/kg)总容积共3ml。实验开始6小时后颈动脉放血处死大鼠。光学显微镜下观察大鼠肺组织病理改变；计算急性肺损伤评分和肺组织湿/干重比值；测定支气管肺泡灌洗液中总蛋白、肿瘤坏死因子-α和巨噬细胞炎性蛋白的浓度；检测肺组织髓过氧化物酶活性；RT-PCR检测肺组织钠氢交换体1Mrna的表达水平; Western blot法检测钠氢交换体1的蛋白表达水平。
结论：钠氢交换体1抑制剂阿米洛利预先给药对大鼠内毒素性急性肺损伤有保护作用；细胞外信号调节激酶的阻滞剂可以完全取消阿米洛利的作用，说明阿米洛利防治大鼠内毒素性急性肺损伤的作用机制可能与抑制细胞外信号调节激酶的激活有关。
第四部分 钠氢交换体1在脂多糖活化鼠源性巨噬细胞中的表达变化及阿米洛利的作用
目的：观察钠氢交换体1Mrna和蛋白在脂多糖活化鼠源性巨噬细胞中的表达变化及阿米洛利预先给药对它的影响。
方法：传代培养的鼠源性巨噬细胞株（RAW264.7细胞）以1×106个／ml的密度接种于6孔板，培养48 h后, 随机分为4组：仅加RPMI 1640培养液的对照组;加300μM阿米洛利的阿米洛利组; 加1μg/ml 脂多糖的脂多糖组; 加300μM阿米洛利干预30min后再加1μg/ml 脂多糖的阿米洛利预给药组; 实验开始24 h后, ELISA法和Griess法分别检测各组细胞培养上清液中肿瘤坏死因子-α浓度和一氧化氮的水平、应用细胞内活性氧敏感性荧光探针DCFH-DA检测各组细胞内活性氧的水平; 实验开始3h后, 采用逆转录－聚合酶链反应（RT-PCR）检测各组细胞内钠氢交换体1Mrna的表达水平; 实验开始6h后，应用免疫印迹（Western blotting）技术检测各组细胞内钠氢交换体1蛋白的表达水平。
结论：脂多糖活化鼠源性巨噬细胞中钠氢交换体1被迅速激活、表达增加；钠氢交换体1抑制剂阿米洛利预先给药干预可以明显抑制这种变化。
脂多糖;急性肺损伤;急性炎症反应;钠氢交换体;核转录因子-Κ
华中科技大学
博士
麻醉学
姚尚龙
2010
中文
R563
2011-11-30（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）