甲酯化脂氧素A4对局灶性脑缺血再灌注损伤的保护作用及其机制研究
第一部分 甲酯化脂氧素A4对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的影响
目的:建立大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤模型并初步观察侧脑室内注射不同剂量甲酯化脂氧素A4（LXA4 ME）在脑缺血再灌注损伤中的效应。
方法:雄性健康SD大鼠48只，体重200～250g，随机分为假手术组（sham组)、缺血再灌注组（I/R组），小剂量甲酯化脂氧素A4组（0.03 Nm LXA4 ME，L组）和大剂量甲酯化脂氧素A4组（0.3 Nm LXA4 ME，H组）。采用线栓法阻塞大鼠右侧大脑中动脉2 h后拔出线栓实施再灌注，制备局灶性脑缺血再灌注损伤模型。于再灌注24 h分别评估大鼠神经功能缺损情况和脑梗死体积，观察脑组织病理变化，测定脑组织髓过氧化物酶（MPO）活性和丙二醛（MDA）含量，酶联免疫吸附法（ELISA）检测细胞因子白介素-1β（IL-1β）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的表达变化。
结果:缺血再灌注24 h大鼠神经功能缺损严重，脑梗死灶明显，缺血中心区顶叶皮层和纹状体外侧可见神经元胞核碎裂、溶解等细胞坏死改变，半暗带额叶皮层和纹状体内侧可见神经细胞稀疏、形态不规则、胞体缩小变形，细胞核固缩深染、部分核消失等，脑组织中MPO活性升高和MDA含量增多，IL-1β和TNF-α含量增多。与I/R组比较，甲酯化脂氧素A4使脑缺血再灌注损伤大鼠神经功能缺损减轻，脑梗死体积缩小，脑组织病理损伤减轻，MPO活性降低、MDA含量下降，IL-1β和TNF-α含量下降。且大剂量甲酯化脂氧素A4较小剂量甲酯化脂氧素A4的治疗效果更明显。
结论:线栓法能制备较理想的大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤模型；甲酯化脂氧素A4能减轻缺血再灌注所致脑组织损伤和神经功能缺损起到脑保护作用。
第二部分:甲酯化脂氧素A4对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤中炎性反应的影响
目的:探讨甲酯化脂氧素A4对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤炎性反应的影响及其可能的作用机制。
方法:雄性健康SD大鼠96只，随机分为假手术组（sham组）、缺血再灌注组（I/R组）、甲酯化脂氧素A4组（LXA4 ME组）。采用线栓法阻断大鼠右侧大脑中动脉2 h后拔出线栓实施再灌注，制备大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤模型。脑缺血开始时向右侧侧脑室注射LXA4 ME 0.3 Nm，sham组和I/R组注射等量生理盐水。再灌注24 h时进行神经功能缺陷评分，2,3,5-三苯基氯化四氮唑（TTC）染色法测定脑梗死体积，HE染色观察脑组织病理形态变化，原位末端脱氧核苷酸转移酶标记法（TUNEL）测定神经元凋亡，免疫组化法测定缺血皮质GFAP和OX42蛋白的表达，分光光度计法测定脑组织MPO活性，硫代巴比妥酸法测定脑组织MDA含量。ELISA法测定再灌注0、6、12和24 h脑组织细胞因子TNF-α、IL-1β， TGF-β1、IL-10的含量；Western blotting和EMSA法检测再灌注24 h脑组织NF-Κβ的转录活化。
结果:与sham组比较，再灌注24 h时I/R组和LXA4 ME组神经功能缺损体征明显，TUNEL染色阳性细胞数增多，GFAP和OX42免疫阳性细胞数明显增多，细胞因子TNF-α、IL-1β、TGF-β1和IL-10含量明显升高，NF-κΒp65蛋白表达增多，DNA结合活性明显增高。与I/R组比较，LXA4 ME组神经功能缺损改善，脑梗死体积缩小，脑组织形态学损伤减轻，TUNEL染色阳性细胞数减少，GFAP和OX42免疫阳性细胞数明显减少，MPO活性降低、MDA含量下降；但IL-1β和TNF-α含量明显降低，TGF-β1和IL-10含量升高，NF-κΒp65蛋白表达减少，DNA结合活性受抑。
结论:甲酯化脂氧素A4可能通过抑制促炎因子IL-1β和TNF-α的表达；上调抗炎细胞因子IL-10和TGF-β1；抑制炎性细胞中性粒细胞的浸润和胶质细胞的活化；抑制与炎症反应有关NF-Κβ的转录活化，从而在大鼠脑缺血再灌注损伤中起到神经保护作用。
第三部分 甲酯化脂氧素A4对脑缺血再灌注损伤后JAK2/STAT3信号通路的影响
目的:探讨甲酯化脂氧素A4能否通过SOCS3负调控与炎性细胞因子有密切关系的JAK2/STAT3信号转导通路而起到神经保护作用。
方法:健康成年雄性SD大鼠，随机分为假手术组（sham组）、脑缺血再灌注组（I/R组）、DMSO（AG490溶剂）治疗组、AG490（JAK2蛋白激酶的特异性磷酸化抑制剂）治疗组、甲酯化脂氧素A4治疗组（LXA4 ME组）。治疗组于脑缺血开始分别向侧脑室注射3％ DMSO 5μl，AG490（100Nm/5μl）, LXA4 ME（0.3 Nm/5μl），sham组和I/R组注射等量生理盐水。采用线栓法制备大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤模型。再灌注24 h时进行神经功能缺陷评分；再灌注6 h和24 h ELISA法检测脑组织中IL-6的含量；再灌注24 h，采用荧光实时定量PCR技术检测STAT3和SOCS3 Mrna的表达，Western blotting检测p-JAK2、p-STAT3蛋白和SOCS3蛋白的表达，免疫荧光法检测p-JAK2、p-STAT3蛋白和SOCS3蛋白在胶质细胞中的表达变化。
结果:与sham组比较，I/R组及DMSO组STAT3 Mrna表达上调，磷酸化激活的JAK2和STAT3蛋白增多，SOCS3 Mrna和蛋白表达增多，胶质细胞中p-JAK2、p-STAT3和SOCS3免疫阳性表达明显增强。与I/R组比较，AG490组能抑制STAT3 Mrna的表达，抑制JAK2和STAT3蛋白的磷酸化激活，减弱p-JAK2、p-STAT3免疫阳性表达，减轻大鼠神经功能缺损。与I/R组比较，LXA4 ME组SOCS3 Mrna和蛋白表达增多，SOCS3在胶质细胞中免疫阳性表达增强，IL-6的含量明显下降，JAK2和STAT3磷酸化蛋白减少，大鼠神经功能缺损减轻。
结论:甲酯化脂氧素A4可以抑制脑缺血后JAK2/STAT3通路的激活，可能是通过上调SOCS3的表达及抑制促炎因子IL-6的过度表达，发挥抗炎和神经保护的作用。
甲酯化脂氧素A4;局灶性脑缺血再灌注损伤;保护作用
华中科技大学
博士
麻醉学
姚尚龙
2010
中文
R743.31
2011-11-30（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）