有机相吸附法固定南极假丝酵母脂肪酶B的研究
本文对有机相吸附法固定化南极假丝酵母脂肪酶B(Candida antarctic lipase B，CALB)进行了较系统的研究。研究了糖作为添加剂对固定化酶酯化活性的影响，并且对糖的影响机理进行了初步探讨；利用自制的固定化CALB催化合成乳酸乙酯，采用Plackett-Burman (PB)及响应面法(RSM)设计实验，对反应条件进行了优化，并研究了酶促合成乳酸乙酯的动力学机制。
首先，从水相吸附、载体涂布和有机相吸附三种吸附固定形式中，筛选出对CALB固定化效率较高的是有机相吸附，并确定了树脂NKA-9为固定化载体，异辛烷为固定化介质。通过单因素和正交实验，考察了吸附时间、酶载比、温度、pH和初水量对固定化酶活性的影响。得到最佳固定化条件为：吸附时间2.5 h、酶载比1:80(质量比)、温度30℃、pH 6.0以及初水量75 μL。此条件下制备得到的固定化酶的活性最高，酶活回收率达83.33[％]。
其次，以酶催化乳酸和乙醇的酯化反应为模型反应，选取糖为添加剂，考察了糖的种类及浓度对固定化酶酯化活性的影响。结果表明海藻糖、蔗糖和葡萄糖的保护效果较为明显。由于海藻糖成本较高，选取蔗糖和葡萄糖进一步考察糖浓度的影响。在所测浓度范围内，蔗糖作为添加剂时乳酸乙酯产率明显高于以葡萄糖为添加剂时的产率，最终确定固定化过程中添加1.5[％](质量/体积)的蔗糖以提高固定化酶活性。选取海藻糖、蔗糖和葡萄糖及其处理过的脂肪酶CALB为样本，通过傅立叶红外光谱初步分析了糖作为添加剂对固定化酶的影响机理。
再次，考察了固定化酶的pH稳定性、热稳定性和操作稳定性。CALB经固定化以后，稳定性较游离酶明显提高，与商品酶Novozym 435相比，也表现出了与其相当的稳定性。比较了固定化酶在水相反应和非水相反应的操作稳定性，表明自制的固定化酶更适用于催化非水相反应。
最后，用自制固定化酶催化乳酸和乙醇的酯化反应。通过Plackett-Burman和RSM实验，对底物摩尔比、底物总量、反应时间、反应温度和摇床转速等五个因素进行了优化，得到各个因素的最佳水平为：底物摩尔比8.3:1(醇酸比)、底物总量0.4 g、反应时间26.87 h、反应温度55℃、摇床转速150 rpm。优化条件下，实验得到乳酸乙酯的最高产率为24.32[％]。并最终建立了自制固定化酶催化乳酸乙酯合成的动力学模型，反应遵循双底物抑制的双乒乓机制，且在本反应体系中，乳酸的抑制作用要大于乙醇。动力学模型的各个参数值为：Vmax=18.20 μmol·mL-1·h-1·g-1，KA=2.289×10-2 mol·L-1，KB=3.931×10-1 mol·L-1，KiA=6.091×10-2 mol·L-1，KiB=1.843 mol·L-1。
有机相吸附法;固定化酶;南极假丝酵母脂肪酶B;B催化合成;乳酸乙酯;酯化活性
河北工业大学
硕士
生物化工
高静
2010
中文
TQ426.97;O623.624.2
51
2011-03-28（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）