乙醇对内皮细胞凋亡的影响及其作用机制;大鼠体内甲基莲心碱浓度测定的HPLC方法学建立
本研究分为二部分：
第一部分：乙醇对内皮细胞凋亡的影响及机制
酒精对健康的影响目前尚存在争议，但长期大量饮酒危害健康却不容质疑，可导致高血压，动脉粥样硬化,心律失常，脑血管意外等。研究表明内皮细胞凋亡与许多心血管疾病的发生发展息息相关。以AS 为例，在粥样斑块的发展过程中凋亡事件发生率升高，另一方面内皮凋亡的增加也能够引发AS。
乙醇的细胞损伤作用，目前大致有直接损伤和氧化损伤两种，就体内所能达到浓度而言，长期大量饮酒造成的细胞损伤作用很大程度上可能与氧化应激有关。探讨乙醇与内皮细胞凋亡的关系、阐明其作用机制，对于深入认识及防治乙醇对心血管系统的损伤具有一定意义。
本研究选取人内皮细胞为研究对象，着重观察乙醇对内皮细胞凋亡的影响并探讨其作用机制。
（一）乙醇对内皮细胞凋亡的影响
目的：观察乙醇对EA.hy926细胞增殖活力及乙醇对内皮细胞凋亡形态学及细胞凋亡率的影响。
方法：体外培养EA.hy926，以0.3%，0.6%，1.0%(v/v)乙醇分别孵育细胞至 6，9，12 h，采用四甲基偶氮唑蓝（3-(4,5-二甲基-2-噻唑)-2，5-二苯基溴化四唑，0.5 mg/mL）
法检测细胞生长抑制率﹑台盼蓝拒染法检测细胞存活率。0.6%乙醇孵育人内皮细胞EA.hy926 至12h，Hoechst 33258荧光染料染色观察细胞发生的凋亡形态学改变。另设阴性对照组，实验组（0.6% 乙醇），联用N-乙酰半胱氨酸组（0.6% 乙醇+10 mmol/LNAC)，单用NAC组（10 mmol/L NAC），各组药物均孵育至12h，采用改良Sub-G1法检测细胞凋亡率的变化。
结果：乙醇（0.3%，0.6%，1.0%）明显抑制内皮细胞生长。乙醇作用内皮细胞6h，随浓度增高，其对细胞生长的抑制率分别为（29.38±1.69）%，（35.98±2.23）%，（40.75±0.55）%；相应地细胞存活率分别为（78.09±9.81）%，（73.60±8.34）%，（69.03±11.56）%。乙醇作用内皮细胞9h，随浓度增高,其对细胞生长的抑制率分别为（12.58±1.44）%，（18.39±3.26）%，（28.62±1.13）%；相应地细胞存活率分别为（85.42±10.97）%，（77.58±5.01）%，（71.85±14.06）%。乙醇作用内皮细胞12h，随浓度增高，其对细胞生长的抑制率分别为（7.57±1.17）%，（10.96±1.28）%，（13.81±0.83）%；相应地细胞存活率分别为（94.72±5.65）%，（89.46±3.67）%，（84.31±9.77）%。0.6%乙醇孵育EA.hy926后，于荧光显微镜镜下观察，出现大量凋亡细胞，其细胞核呈致密浓染。细胞凋亡率也从对照组的(0.49±0.16)% 明显上升至 (5.31±0.54)%(P﹤0.01)，而联用NAC组细胞凋亡率降低至(1.28±0.24）%，较实验组显著降低(P ﹤ 0.01)。
结论：乙醇（0.3%，0.6%，1.0%）抑制人内皮细胞EA.hy926 生长，在相同作用时间下，随乙醇浓度的增加该抑制作用增强。0.6%乙醇能够诱导内皮细胞发生凋亡，NAC则能减少乙醇诱导的凋亡。
（二）乙醇诱导内皮细胞凋亡的作用机制
目的：观察乙醇对EA.hy926细胞SOD活力，MDA含量，细胞活性氧（ROS）水平及细胞游离钙离子浓度（[Ca2+]I）的影响。
方法：实验分阴性对照组，实验组（0.6% 乙醇），联用NAC组（0.6% 乙醇+10mmol/L NAC)，单用NAC组（10 mmol/L NAC），各组药物均孵育至12h。取细胞超声裂解液，检测细胞SOD活力和MDA含量。另取各组细胞，采用荧光探针DCFH-DA检测细胞ROS 及荧光染料Fura-2/AM检测内皮细胞[Ca2+]I。
结果：与阴性对照组比，实验组SOD活力由40.8±2.9 U/mg protein 显著降低到29.2±4.0 U/mg protein、MDA含量由46.5±3.8 nmol/mg protein 升高到89.5±5.6 nmol/mgprotein、ROS荧光强度从93.69±7.58 升高到162.30±18.85 (P ﹤ 0.01)；而联用NAC组较实验组，MDA含量显著降低至45.4±3.3 nmol/mg protein、SOD活力增加至37.9±3.0U/mg protein、ROS荧光强度降低为114.35±9.63 (P ﹤ 0.01)。0.6%乙醇处理12 小时后，胞内[Ca2+]I 为(183.8±19.9)nmol/L，与对照组(149.0±18.0）nmol/L 相比，明显升高(P ﹤ 0.05)；使用抗氧化剂NAC后，胞内[Ca2+]I 明显降低至(158.2±8.6)nmol/L。
结论: 0.6%乙醇处理EA.hy926后，细胞ROS 水平、MDA含量和细胞内[Ca2+]I均显著升高，而SOD活力明显降低。而NAC可以减轻乙醇引起的上述效应。
第二部分：大鼠体内甲基莲心碱浓度测定的方法学建立
目的：建立大鼠血浆和肝脏匀浆中甲基莲心碱浓度测定的高效液相色谱法。
方法：大鼠血浆和肝脏匀浆样品经乙醚萃取，进样分析。采用Hypersil BDS C18（5μm，4.0 mm×250 mm)柱分离，柱温: 25 ℃。流动相：甲醇︰0.2 M KH2PO4 ︰0.2 M NaOH︰三乙胺 (71 ︰17 ︰12 ︰0.002 v/v/v/v)，pH 9.2～9.3，0.45 μm 减压抽滤，超声脱气5 min，流速0.8 ml/min；进样量：20 μL；紫外检测波长：282 nm。
结果：血浆中甲基莲心碱的线性范围为0.03125～2.00 μg/mL；日内和日间精密度(RSD)分别为小于8.0%和5.0%，绝对回收率为80.4%～89.2%。其在肝脏匀浆中的线性范围为0.0625～16.0 μg/mL，日内和日间RSD 均小于3.0%，绝对回收率为82.5%～88.4%。
结论：该方法能满足生物样品的检测要求，可应用于大鼠血浆和肝脏匀浆中甲基莲心碱浓度的测定。
酒精;心血管系统;内皮细胞凋亡;甲基莲心碱;浓度测定;HPLC法
华中科技大学
硕士
药理学
向继洲
2007
中文
R541.02
39
2011-03-14（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）