IbAOMT基因对甘薯花青素修饰和抗氧化能力的影响
花青素是植物天然色素，在植物的生长发育及对抗逆境中起重要作用。花青素甲基转移酶（AOMT）能够将花青素从3大类丰富到6大类，使其结构稳定、颜色多样并稳定储存在液泡中。甘薯富含矢车菊素和芍药素，其花青素研究多聚焦在前期类黄酮支架的合成上，对后期催化矢车菊素生成芍药素相关的甲基化修饰研究却未见报道。因而加强对甘薯花青素甲基化修饰研究尤为重要，有利于对甘薯花青素进行种类优化和功能开发，有利于培育抗逆性强和营养价值高的甘薯品种。 为阐明甘薯花青素甲基化修饰的原理，培育高花青素和高抗逆性甘薯，本课题以IbAOMT1和IbAOMT2的体外酶活实验为基础，创建拟南芥与甘薯过表达株系进行体内酶活实验，验证了IbAOMT1和IbAOMT2基因的生物学功能，解析了甘薯中花青素甲基化修饰的原理。研究结果如下： （1）体外酶活实验发现IbAOMT2酶可以催化S-腺苷甲硫氨酸（SAM）作为甲基供体与矢车菊素3-葡萄糖苷发生反应，使矢车菊素3-葡萄糖苷的B环3''位羟基甲基化生成芍药素3-葡萄糖苷，证实了IbAOMT2基因在体外的功能，为后续获得拟南芥和甘薯转基因植株奠定了前期基础。 （2）在拟南芥中创建AOMT1-OE和AOMT2-OE转基因株系，转基因植株花青素含量显著增加。野生型花青素含量是0.17mg/g，转基因株系花青素是野生型的4.9-7.7倍。通过LC-MS分析花青素组分，发现转基因植株中新增加了芍药素3-O-[2''''-O-（6''''''-O-（芥子酰基）木糖基）6''''-O-（对-O-（葡萄糖基）对香豆油基）葡萄糖苷]5-O-（6''''''''-O-丙二酰基）葡萄糖苷，是由矢车菊素3-O-[2''''-O-（6''''''-O-（芥子酰基）木糖基）6''''-O-（对-O-（葡萄糖基）对香豆油基）葡萄糖苷]5-O-（6''''''''-O-丙二酰基）葡萄糖苷的B环3''位置经甲基化修饰生成，证实了IbAOMT1和IbAOMT2基因在拟南芥体内具有催化花青素甲基化和提高花青素总含量的功能。 （3）甘薯中过表达IbAOMT1和IbAOMT2基因获得转基因株系，根据IbAOMT1与IbAOMT2基因表达量和转基因株系表型，选取AOMT1-1、AOMT1-2、AOMT2-1和AOMT2-2过表达株系作后续研究。对甘薯各组织花青素含量检测结果显示，块根中的花青素含量最高，其次是茎和叶。且转基因株系各组织的花青素含量都显著高于野生型。例如，野生型块根的花青素含量为2.80mg/g，而转基因株系中的花青素含量增加了2.3-3.8倍；另外，转基因株系茎和叶中的花青素分别较野生型增加了1.6-3.0倍和3.3-5.4倍。 通过LC-MS检测甘薯中花青素组分，转基因株系中花青素组分由野生型的16种增加到23种，增加了5种芍药素和2种矢车菊素。可能是甘薯内源甲基转移酶的底物偏好性以及含量的影响，因此无法催化所有类型的矢车菊素甲基化。过表达IbAOMT1或IbAOMT2基因，极大提高了甲基转移酶的活性，从而催化更多种类的矢车菊素甲基化生成芍药素，丰富了甘薯体内花青素的组分和含量。 我们发现过表达株系Lf4中花青素通路合成相关基因DFR、F3''H、ANS、3GT、IbAOMT1和IbAOMT2基因的表达量均显著上调。说明在甘薯中过表达IbAOMT1或IbAOMT2基因，可以增强甲基转移酶对底物矢车菊素的需求，诱使矢车菊素合成通路相关基因表达，催化产生更多矢车菊素参与甲基化反应，提高通路中矢车菊素甲基化生成芍药素的效率。 甘薯中过表达IbAOMT1或IbAOMT2基因，随着花青素含量的增加，转基因植株的抗氧化性也显著提高，是野生型的1.57-5.87倍。块根中的光合产物含量出现显著增加，转基因植株蔗糖含量是野生型的1.89-5.40倍；可溶性糖含量是野生型1.60-4.26倍；淀粉含量是野生型的1.20-1.51倍。 综上所述：本实验从甘薯中克隆到IbAOMT1和IbAOMT2基因，首先在体外进行酶活实验，其次在拟南芥中进行异源表达，均验证其具有催化矢车菊素甲基化的功能。最后在转基因甘薯中发现AOMT酶含量提高能够显著增加矢车菊素向芍药素转化的效率，引起花青素合成相关基因表达量的上调，导致转基因甘薯中花青素含量、抗氧化性和同化产物产量显著增加。本研究结果有利于我们利用分子育种手段，人为调控甘薯体内花青素总含量和组分，从而研发出具有高营养、强抗逆性和高商业化价值的甘薯。
甘薯;花青素;甲基转移酶;矢车菊素;芍药素
西华师范大学
硕士
环境科学
康乐;王红霞
2023
中文
S531.024
2024-01-02（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）