非洲猪瘟病毒快检方法的建立及免疫逃逸机制研究
非洲猪瘟(African swine fever ，ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus ， ASFV)引起的一种致命的传染性疾病，威胁着全球养猪业和国家经济。ASF 发病急，传播速度快，最早于 1921 年在非洲暴发，随后蔓延至欧洲、南美、东南亚，于 2018年传入中国。ASFV是目前唯一已知的DNA虫媒病毒，主要在软蜱、非洲野猪、野猪和家猪之间传播，非洲野猪不会因感染ASFV出现临床症状，但ASFV对家猪和野猪会造成致命性疾病。ASFV是具有二十面体结构的胞质大DNA病毒，与宿主具有复杂的相互作用机制，能够逃避宿主免疫系统，尚无安全有效的疫苗和药物。目前对 ASF的防控主要依赖于对感染动物的隔离、扑灭和严格的生物安全管控；对病原体快速准确的监测是预防非洲猪瘟暴发最重要的干预措施。因此，建立 ASFV 快速准确的检测方法及阐明ASFV调控宿主免疫应答的机制，将为有效的控制ASF和开发安全有效的疫苗奠定基础。 研究目的： （1）目前基于TaqMan探针的荧光定量PCR检测方法广泛应用于ASFV早期检测，但探针价格昂贵和检测灵敏度有限。因此本研究拟建立一种经济快速、准确灵敏的TB Green qPCR检测方法用于非洲猪瘟病毒的早期筛查。 （2）ASFV 基因结构复杂，病毒基因与宿主相互作用机制尚不完全清楚，制约了ASF疫苗的研发。因此本文拟研究病毒基因与宿主的相互作用，分析ASFV 逃逸宿主免疫应答的机制，以期为开发安全有效的疫苗提供新的策略。 研究方法： （1）建立非洲猪瘟病毒的TB Green qPCR检测方法 将30个ASFV毒株来源的P72基因进行多重序列比对，根据其保守区域设计两对特异性引物。以含P72基因保守区域目的片段的重组标准质粒PUC57-P72为模板，建立荧光染料TB Green qPCR检测方法，绘制标准曲线并筛选最佳引物对。通过优化TB Green qPCR反应体系和条件，提高最佳引物对的检测灵敏性，并进行重复性测试。选用常见猪病毒如猪流感病毒H1N1、猪圆环病毒2型（PCV2）、猪伪狂犬病病毒（PRV）、猪细小病毒（PPV）的核酸与 ASFV 标准质粒为模板进行特异性试验；通过检测已知ASFV阳性和阴性参考样品评估方法的检出符合率。 （2）生物信息学分析ASFV B119L和MGF360-13L对3D4/21细胞基因表达的影响 分析感染ASFV低致病性OURT88/3和高致病性Georgia 2007/1 的猪全血RNA-Seq转录组数据。构建分别含ASFV B119L和MGF360-13L过表达质粒，转染3D4/21细胞，用RT-qPCR检测转染基因的表达情况。转录组测序分析质粒转染后宿主细胞差异基因的变化情况，利用 GO 富集分析差异基因参与的功能调控，RT-qPCR 检测验证相关基因的表达情况。 （3）ASFV MGF360-13L和ZDHHC1影响3D4/21细胞I型干扰素信号通路的机制研究 利用 HPA 数据库分析 ZDHHC1 在组织中的分布和细胞中的表达情况。用 siRNA靶向沉默ZDHHC1，并用RT-qPCR、Western Blot检测方法验证ZDHHC1的抑制效果。MGF360-13L过表达质粒和ZDHHC1 siRNA（siZDHHC1）分别转染3D4/21细胞，并用poly(I:C)刺激转染细胞，检测干扰素-β及下游关键的干扰素刺激基因MX1、OAS1、ISG15的转录水平。 研究结果： （1）优选的基于ASFV P72基因的特异性引物对及反应体系，能扩增（1.0～1.0） ×106copies/μL 的 ASFV P72 标准质粒，建立的标准曲线 R2可至 0.9954，检测下限是1copies/μL。TB Green qPCR扩增反应采用两步法，检测时间lt;1 h。批次内变异系数lt;1%，批次间变异系数lt;2%。该方法针对 ASFV 扩增的特异性强，检测其它 4 种感染猪常见病毒（H1N1、PCV2、PRV、PPV）均未发生交叉反应，对临床样本的检出符合率为100%。 （2）ASFV低毒株感染致病猪的差异基因在I型IFN信号通路大量富集，高毒株感染后该通路基因却无明显变化。ASFV B119L和MGF360-13L过表达质粒转染3D4/21细胞后，在细胞内高表达。生物信息学筛选出ZDHHC1为MGF360-13L调控宿主细胞天然免疫应答关键靶基因，MGF360-13L抑制ZDHHC1 mRNA转录。 （3）HPA 数据库分析显示 ZDHHC1 在组织中分布广泛，在巨噬细胞中高表达。siZDHHC1在分子和蛋白水平有效抑制ZDHHC1表达。MGF360-13L和siZDHHC1抑制IFN-β及干扰素刺激基因MX1、OAS1、ISG15的mRNA转录。 主要结论： （1）建立的用于非洲猪瘟病毒检测的TB Green qPCR检测方法具有检测时间短、检测特异性强、检测灵敏度高的特性。 （2）ASFV高毒株抑制I型IFN信号通路的富集，ASFV MGF360-13L参与宿主细胞的天然免疫应答调控，有效靶向 ZDHHC1。MGF360-13L 和 siZDHHC1 抑制 IFN-β及下游干扰素刺激基因的mRNA转录。 创新性和研究意义 （1）研究建立了灵敏性高、特异性强，重复性好的非洲猪瘟病毒检测方法，有助于非洲猪瘟病毒感染的快速诊断和群体筛查。 （2）研究发现ASFV多基因家族的MGF360-13L抑制宿主细胞ZDHHC1表达，调控宿主的天然免疫应答。为进一步阐明病毒的免疫逃逸机制和开发安全有效的非洲猪瘟疫苗提供了新的策略。
非洲猪瘟;病毒感染;快速检测;免疫逃逸
陆军军医大学
硕士
微生物学
李晋涛
2022
中文
S858.28;S855.3
2024-01-02（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）