非洲世系寨卡病毒关键神经毒力位点的鉴定
寨卡病毒于1947年发现于非洲乌干达的寨卡森林的猴体而得名，直到2007年该病毒所致人类病例极少而未被重视。2015年南美暴发了历史上最大规模的寨卡疫情，因其感染导致新生儿小头畸形而被WHO列为“国际突发的公共卫生事件”。寨卡病毒具有明确的神经嗜性，可分为非洲世系和亚洲世系，先前的研究发现，非洲世系中的MR766、IbH等代表毒株的乳鼠神经毒力要显著强于亚洲世系，然而造成二者神经毒力差异的机制还不清楚。我们提出假设：不同世系寨卡病毒的可能存在一个或多个保守性氨基酸位点突变，进而导致神经毒力呈现不同的特征。 为探究造成寨卡病毒非洲世系与亚洲世系之间的神经毒力差异的原因，我们首先通过生物信息学方法，分析并筛选非洲世系寨卡病毒株上的潜在毒力位点；通过反向遗传学手段，分别构建并拯救携带潜在毒力位点的突变病毒，并在细胞和动物水平鉴定突变病毒的基本生物学特性，在此基础上着重评价了神经毒力增强株K101R的神经嗜性。最后基于生化实验等手段分析K101R对蛋白结构和功能影响，探究了K101R突变致寨卡病毒神经毒力增强的分子机制。 本课题的主要研究内容和发现如下： 一、携带潜在毒力位点突变的重组寨卡病毒的设计与拯救 为筛选非洲世系寨卡病毒潜在的神经毒力位点，首先通过MEGA软件对目前已发表的32株寨卡病毒的全长氨基酸序列进行了系统进化分析，构建了寨卡病毒系统进化树；进一步选取非洲和亚洲世系寨卡病毒代表株，通过全长序列比对和氨基酸保守性分析，并结合已有的文献报道，确定位于结构蛋白中的7个位点作为突变靶点。为了探究各潜在毒力位点的具体影响，我们通过反向遗传学方法，利用定点突变技术，将相应突变引入亚洲株的感染性克隆，利用反向遗传学拯救获得了6个突变病毒K101R，V110I，V125I，P148A，I459V，L728F，上述病毒均可在BHK-21细胞上形成空斑，有效表达病毒蛋白，并在BHK-21细胞中有效复制。 二、K101R重组寨卡病毒的嗜神经性评价 为了筛选出关键的神经毒力位点，我们通过比较各突变病毒之间的神经毒力差异，利用乳鼠神经毒力实验，将各突变病毒颅内注射新生乳鼠，比较各组乳鼠的生存曲线，发现了一株强毒力特征的突变病毒K101R。为了探究该位点的突变对寨卡病毒嗜神经性的具体影响，我们通过测定病毒生长曲线以及颅内复制力，比较K101R突变株与WT的差异。在体外实验中我们发现K101R突变株在神经细胞上有着更强的增殖能力，体内实验表明K101R颅内复制力更强，有着更强的神经嗜性。上述研究表明，第101位氨基酸是一个影响寨卡病毒神经毒力的关键位点，K101R突变可以显著增强寨卡病毒的神经毒力，该突变株在神经细胞上表现出更强的增殖能力，并在体内也表现出高致病性和神经毒力。 三、衣壳蛋白K101R重组寨卡病毒毒力增强的机制探究 为了进一步探究该位点是如何影响病毒毒力，我们从101位点所在的C蛋白结构和功能特征出发，通过RNA复制动力学分析以及蛋白的表达及功能评价，测定了K101R突变对病毒RNA复制、C蛋白表达，以及C蛋白的核酸结合能力的影响。结果表明该突变并未产生显著影响。另外又通过对感染鼠脑的转录组测序，探究对乳鼠鼠脑转录组的影响，发现感染了该病毒的鼠脑炎症因子转录水平显著升高，说明K101R突变株引起更严重的炎症反应。本部分研究表明，K101R突变并未影响病毒RNA的复制以及蛋白的合成等病毒自身的成熟机制，其强毒力特征主要表现在与宿主的相互作用中，导致宿主脑组织更强的炎症反应。 综上所述，我们前期通过生物信息学筛选出潜在的神经毒力位点，以反向遗传学构建并拯救了系列突变病毒，通过动物模型筛选出其中的强毒力毒株K101R，并进一步评价了该突变株的神经毒力，发现该突变增强了寨卡病毒对人神经细胞的嗜性，且增强了在乳鼠颅内的增殖能力。我们进一步评价了该突变对衣壳蛋白的结构与功能的影响，发现该位点的突变并未影响病毒的包装以及成熟过程，而鼠脑转录组结果表明，该位点主要增强了病毒与宿主神经系统的相互作用，诱导脑组织产生更强的炎症反应。本研究发现了寨卡病毒基因组上一个新的关键位点101，加深了人类对寨卡病毒非洲世系与亚洲世系的认识；另外该位点的发现也为病原监测提供了新的参考，虽然目前寨卡病毒的流行株未报道含有K101R的突变，但对该为位点的监测有利于及时对其进行预警，对公共卫生事业具有重要意义。
寨卡病毒;神经毒力;定位突变;衣壳蛋白;反向遗传学
安徽医科大学
硕士
微生物学
秦成峰
2022
中文
R373.3
2023-12-12（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）