游仆虫胞内共生菌多样性分析及互作机制研究
共生是生态学和进化生物学中普遍而重要的现象，几乎所有的真核生物类群都存在共生现象。自1952年Fauré-Fremiet首次在盘状游仆虫（Euplotespatella）中发现共生菌以来，已先后在游仆虫中鉴定到27种胞内共生菌。游仆虫的胞内共生菌可分为两类，一类是宿主生存必不可少的必需共生菌（essentialsymbionts），另一类是伴随必需共生菌存在的附属共生菌（accessorysymbionts）。目前已在游仆虫中鉴定到27种胞内共生菌，其中包括6种必需共生菌和21种附属共生菌，其中最常见的必需共生菌是必需多核杆菌（Polynucleobacternecessarius）。P.necessarius是一种专性胞内共生菌，在宿主体外不能存活；同时它又是一种必需共生菌，当用抗生素将游仆虫胞内的P.necessarius完全去除后，游仆虫无法正常分裂。但二者之间专性共生的分子机制尚不清楚。本研究对采自不同地区的八肋游仆虫和艾美游仆虫的共生菌多样性进行了分析，并对宿主游仆虫及其必需共生菌P.necessarius的基因组进行分析，所得结果如下： 1.游仆虫胞内共生菌的鉴定 对八肋游仆虫Zam5b-1及艾美游仆虫进行宏基因组测序，利用IlluminaNovaSeq平台进行双端测序，分别得到9.65Gb和9.64Gb的原始数据；对原始数据进行处理、拼接后，以P.necessarius（LT606951）的16SrDNA基因序列为查询序列，通过blastn搜索鉴定可能的共生菌16SrDNA基因序列。结果表明艾美游仆虫中只存在P.necessarius一种共生菌，而八肋游仆虫Zam5b-1中共有五种共生菌，包括P.necessarius、CandidatusMegairapolyxenophila、Ca.Anadelfobacterveles、Ca.Euplotellasexta和一种UnculturedChlamydialesbacterium；利用荧光原位杂交（fluorescenceinsituhybridization,FISH）技术对八肋游仆虫Zam5b-1中已报道的四种共生菌进行验证，均得到较强的阳性信号，且细菌形状大小各异；对UnculturedChlamydialesbacterium的16SrDNA基因全长序列进行同源性分析及系统发育分析，结果表明该共生菌属于衣原体门、衣原体纲（Chlamydiia）、Parachlamydiales目、Rhabdochlamydiaceae科，与Ca.Rhabdochlamydiaporcellionisstrain15C的16SrDNA序列一致性为92.09%，所以我们建立了一个新的属CandidatusEuplotechlamydia，并将该共生菌命名为CandidatusEuplotechlamydiaquinta。根据Ca.Euplotechlamydiaquinta的16SrDNA序列，设计特异性探针Rha189进行荧光原位杂交，结果表明该细菌呈短棒状，均匀分布在细胞质中。此外，同时使用细菌通用探针EUB338和P.necessarius特异性探针Poly_862对艾美游仆虫中的共生菌进行荧光原位杂交，发现两种探针的荧光信号完全重叠，表明艾美游仆虫中确实只存在P.necessarius一种胞内共生菌。 2.游仆虫中Polynucleobacternecessarius基因组拼接、注释及代谢分析 从宏基因组数据中拼接得到艾美游仆虫和八肋游仆虫Zam5b-1中必需共生菌P.necessarius的完整基因组序列，大小分别为1.7Mb、1.9Mb，G+C含量分别为46.1%和44.6%，分别含有2125和2957个基因，各包括356个和630个假基因；与自由生P.necessarius相比，共生株系基因组大小明显减少，编码基因的能力明显降低，主要是因为含有大量的假基因；对必需多核杆菌的16SrDNA基因序列进行系统发育分析，结果显示八肋游仆虫的三个共生株系P.necessarius聚为一支，亲缘关系较近，对23个类群的细菌基因组基于521个单拷贝直系同源基因进行系统基因组分析，它们的系统发育位置表明，与宿主游仆虫密切相关的共生多核杆菌是从不同的自由生的多核杆菌进化而来的；鉴于艾美游仆虫只含有P.necessarius，有利于后续深入分析二者之间的共生关系，因此对艾美游仆虫中P.necessarius的代谢通路进行分析，并与自由生P.necessarius进行比较，结果表明自由生和共生的P.necessarius均有完整的三羧酸循环途径、戊糖磷酸途径非氧化阶段以及14种氨基酸生物合成途径，但共生P.necessarius没有完整的乙醛酸循环途径，没有天冬氨酸、谷氨酸、丙氨酸、甲硫氨酸、丝氨酸、组氨酸六种氨基酸生物合成途径，不能从环境中吸收硝酸盐和硫酸盐，也无法合成辅酶B12、硫胺素及生物素等辅因子。因此推测共生P.necessarius可能需要宿主为其提供碳源、有机氮、有机硫以及某些辅因子。 3.游仆虫胞内必需共生菌的多胺代谢途径分析 前期研究表明，自由生P.necessarius基因组均含有完整的有功能的胺氧化酶基因，而所有共生P.necessarius基因组中的胺氧化酶基因均发生丢失或成为假基因。胺氧化酶负责细胞内多胺的氧化降解，因此本研究对已完成测序的宿主游仆虫及必需共生菌基因组中的多胺代谢途径进行了分析，并与自由生菌株进行了比较。结果表明八肋游仆虫及艾美游仆虫大核基因组中多胺生物合成途径完全缺失，因此它们不能合成任何一种多胺；自由生Polynucleobacter以及自由生Fluviibacter中都存在胺氧化酶基因，而大部分必需共生菌中胺氧化酶都为假基因，在小腔游仆虫Eae6的Ca.Protistobacterheckmanni及八肋游仆虫VTN8的F.phosphoraccumulans中均没有胺氧化酶基因；鸟氨酸脱羧酶（Ornithinedecarboxylase,Odc）负责腐胺的合成，该基因在所有自由生及共生菌株的基因组中都存在，仅E.platystomaNa2中的必需共生菌Ca.Devosiasymbiotica未找到该基因，可能是其基因组拼接不完整造成的；亚精胺合成酶存在于20种细菌中，但在共生菌Ewo1、Eae2和POH1中为假基因；此外，所有细菌类群中均没有鉴定到S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶基因。基于以上结果，我们推测游仆虫中的必需共生菌可能为宿主提供腐胺。 本研究对两种游仆虫中的共生菌进行鉴定，其中艾美游仆虫中只存在必需多核杆菌一种共生菌，而八肋游仆虫Zam5b-1中有五种共生菌，且在八肋游仆虫Zam5b-1中鉴定到一类新的附属共生菌Ca.Euplotechlamydiaquinta。基于宏基因组数据，得到艾美游仆虫与八肋游仆虫中必需多核杆菌的完整基因组序列，并通过代谢通路分析，发现必需共生菌需要宿主为其提供碳源、有机氮、有机硫以及某些辅因子等。胺氧化酶可催化生物胺降解，而共生菌中的胺氧化酶均为假基因，但负责合成腐胺的鸟氨酸脱羧酶基因存在于几乎所有必需共生菌的基因组中，推测必需共生菌可能为宿主游仆虫提供腐胺。本研究丰富了对游仆虫共生菌多样性的认识，并为深入理解游仆虫与必需共生菌之间专性共生的分子机制提供了新思路。
游仆虫;共生菌;基因组;系统发育
山西大学
硕士
微生物学
王软林
2023
中文
Q959.117.03
2023-11-30（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）