LINC01480在短期氢醌染毒致TK6细胞S期阻滞中作用研究
目的： 初步探讨LINC01480在氢醌致TK6细胞周期改变中作用，在此基础上探索LINC01480下游miRNA及其靶基因。 方法： 1.用qRT-PCR技术检测白血病患者骨髓样本、恶性转化细胞HQ19、白血病细胞系：THP-1、KG-1、U937、K562中LINC01480的表达情况。 2.不同浓度HQ染毒TK6细胞24h，用qRT-PCR技术检测LINC01480表达变化，CCK-8法检测细胞活力变化，细胞计数法计算细胞增殖指数变化，流式细胞术检测TK6细胞周期变化。 3.用生物学技术分别构建高表达和低表达LINC01480质粒，利用慢病毒转染技术构建TK6细胞低表达、过表达LINC01480细胞系（RNAi-01480、LV-01480），CCK-8法检测TK6细胞活力变化，细胞计数法计算TK6细胞增殖指数变化，流式细胞术检测TK6细胞周期变化。 4.不同浓度HQ染毒TK6细胞24h，用qRT-PCR技术检测LINC01480的亚细胞定位变化。 5.通过生物信息学和在线数据库（TargetScan和miRanda）分析预测LINC01480下游miRNA；用qRT-PCR技术检测miRNA在不同处理的TK6细胞中表达变化；用双荧光素酶基因报告实验做结合位点验证。 6.用生物学技术分别构建高表达和低表达miR-99a-3p质粒，利用慢病毒转染技术构建TK6细胞低表达、过表达miR-99a-3p细胞系（RNAi-99a-3p、LV-99a-3p）；用qRT-PCR技术检测LINC01480表达变化，CCK-8法检测TK6细胞活力变化，细胞计数法计算TK6细胞增殖指数变化，流式细胞术检测TK6细胞周期变化。 7.通过生物信息学和在线数据库（TargetScan和miRanda）分析预测miR-99a-3p下游靶基因，用qRT-PCR技术、Western blot技术检测靶基因在不同处理的TK6细胞中表达变化；用双荧光素酶基因报告实验做结合位点验证。 结果： 1.LINC01480在HQ所致恶转TK6细胞和U937、K562白血病细胞系中呈低表达。 2.不同浓度HQ染毒TK6细胞24h后LINC01480表达上升；细胞增殖活力随HQ浓度升高而下降；细胞的增殖指数表现为下降，发生G1/S期阻滞。 3.应用过表达和低表达慢病毒转染LINC01480，结果显示，TK6高表达LINC01480细胞72h内对细胞增殖先增加后趋于相同，低表达LINC01480细胞则表现为增殖受到抑制；HQ染毒TK6细胞高表达LINC01480细胞系24h，细胞增殖指数为0.99，TK6细胞低表达LINC01480则为0.90；TK6细胞高表达LINC01480，S期增加，促进HQ所致的S期阻滞；TK6细胞低表达LINC01480，S期下降，抑制HQ所致的S期阻滞。 4.LINC01480主要定位在细胞核；不同浓度HQ染毒TK6细胞24h后，细胞质中的LINC01480随HQ浓度升高而升高。 5.通过生物信息学和在线数据库分析预测发现，LINC01480与miR-99a-3p可能存在结合位点，20μM HQ染毒TK6细胞24h后，miR-99a-3p表达下降；高表达LINC01480TK6细胞中，miR-99a-3p表达下降，低表达LINC01480TK6细胞中，miR-99a-3p表达升高；双荧光素酶报告基因实验结果显示，LINC01480与miR-99a-3p存在结合位点，LINC01480可能结合miR-99a-3p调控下游靶基因的表达。 6.应用过表达和低表达慢病毒转染miR-99a-3p，结果显示过表达miR-99a-3p，LINC01480表达变化无统计学差异，低表达miR-99a-3p，LINC01480表达升高；高表达和低表达miR-99a-3p的细胞增殖受到抑制，后者的细胞增殖抑制更加明显；HQ染毒TK6细胞高表达miR-99a-3p细胞系24h，细胞增殖指数为0.93，TK6细胞低表达miR-99a-3p则为0.99；TK6过表达miR-99a-3p，对细胞周期和HQ所致细胞周期阻滞影响不明显，低表达miR-99a-3p，细胞S期增加，促进HQ所致的S期阻滞。 7.通过生物信息学和在线数据库分析预测发现，miR-99a-3p和HS3ST2、RND3可能存在结合位点；短期HQ染毒TK6中的HS3ST2和RND3表达上升，低表达LINC01480，HS3ST2和RND3表达下降，过表达miR-99a-3p，HS3ST2和RND3表达下降，低表达miR-99a-3p，HS3ST2表达升高；Western blot结果显示RND3与LINC01480表达相同，与miR-99a-3p表达相反；双荧光素酶报告基因实验结果显示，miR-99a-3p与RND3之间没有结合位点，与HS3ST2之间存在结合位点，HS3ST2可能是miR-99a-3p的一个靶基因。 结论： LINC01480在HQ所致恶转细胞和U937、K562白血病细胞系中呈低表达；短期HQ染毒可使LINC01480表达增加和促进细胞周期阻滞，LINC01480可能通过海绵样吸附miR-99a-3p促进HS3ST2表达。
氢醌;短期染毒;LINC01480基因;TK6细胞;S期阻滞
广东医科大学
硕士
卫生毒理学
唐焕文
2022
中文
R996
2023-12-12（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）