副溶血性弧菌在中华锯齿米虾内的动态分布及引发的免疫响应机制
副溶血性弧菌（Vibrioparahaemolyticus）是一种能够在全球范围内引发五十多种水产养殖动物患弧菌病的条件致病菌，同时也是重要的人类病原菌，严重危害着水产养殖动物和人类的健康。中华锯齿米虾（Neocaridinadenticulatasinensis）作为亚洲分布广泛的小型虾类，具有易于饲养、生长迅速、繁殖力强等特点，适合作为软甲纲十足目动物进行生态及毒理学实验研究的生物模型。然而，目前对于副溶血性弧菌感染中华锯齿米虾后引发的免疫响应机理还未有深入研究，尤其是该病原微生物在宿主体内的分布和定植情况研究较少，主要原因是缺乏合适的标记对弧菌进行检测。本研究利用增强型绿色荧光蛋白（EnhancedGreenFluorescentProtein，EGFP）构建了荧光标记的副溶血性弧菌基因工程菌，对该病原微生物在中华锯齿米虾内的动态分布情况展开研究，确定参与免疫响应的重要靶组织。进一步利用转录组测序技术分析基因表达情况，以期为中华锯齿米虾应对副溶血性弧菌免疫响应机制的研究提供理论依据，并为甲壳动物弧菌病害的防治提供参考信息。主要研究结果如下： 1.利用无缝克隆技术将卡那霉素抗性基因和EGFP基因插入到原核表达载体pCT7-CHISP6H，并通过电击转化法导入到副溶血性弧菌中，构建出了具有合适筛选标记且能高效表达荧光的重组弧菌V.parahaemolyticus-EGFP。传代培养实验表明，EGFP作为报告基因在副溶血性弧菌中具有较好的稳定性，为感染示踪的研究提供基础。 2.人工感染实验表明EGFP对副溶血性弧菌的致病性无明显影响且该菌对中华锯齿米虾的有效作用浓度在5.1×105-2.2×107CFU/mL范围内。进一步利用细菌计数法和激光扫描共聚焦显微镜探究了副溶血性弧菌在中华锯齿米虾体内的动态分布情况，结果表明肠道是该病原微生物黏附和定植的主要部位，鳃和肝胰腺组织在抵抗该病原过程中发挥着重要的清除作用。 3.鉴于目前缺乏中华锯齿米虾鳃组织免疫响应机制的研究，本文通过转录组测序技术进一步探讨了中华锯齿米虾鳃组织响应副溶血性弧菌感染的分子调控机制，共鉴定出1358个差异表达基因。基于GO和KEGG注释结果对差异基因筛选和分析，得到许多免疫相关基因，涉及溶酶体信号通路、代谢过程、几丁质结合蛋白、丝氨酸蛋白酶，表明鳃组织在抗菌免疫中发挥重要作用。此外，利用qRT-PCR对免疫相关基因的表达水平进行了检测，结果与转录组数据基本一致。
中华锯齿米虾;增强型绿色荧光蛋白;转录组;免疫响应;副溶血性弧菌
河北大学
硕士
微生物学
孙玉英
2023
中文
S968.22
2023-11-29（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）