Circ_0044516靶向miR-1281促进食管癌细胞增殖、抑制细胞凋亡
食管癌（Esophageal cancer，EC）是一种好发于食管中段和下段的恶性肿瘤，其发病率高，侵袭性极强，死亡率很高,是癌症特异性死亡的第六大原因。目前，局灶性食管癌治疗的主要方式仍然是食管切除术，但该治疗伴随着相当高的术后发病率和死亡率。尽管该病在早期诊断和治疗策略方面有所进展，但EC患者总生存率仍低于大多数实体瘤。环状RNAs（circRNAs）是一类具有共价闭合结构的单链环状转录物，具有高稳定性和进化保守性。研究发现circRNA具有一系列重要的细胞生物学功能，在作为癌症标志物方面具有明显优势。Circ_0044516是一个新发现的功能circRNA，并且已被证实参与多种癌症的发生发展，但其在EC的功能尚未被研究。此外，circRNAs可能与其他RNA结合并隔离RNA结合蛋白(RBPs)，甚至与其他RNA结合并隔离碱基对以调节其活性。许多circRNAs作为内源性竞争RNA（ceRNA）或miRNA海绵在癌症发展中发挥调节作用。miR-1281是一个功能miRNA，已有研究表明其在癌症发展中发挥重要调控作用。但Circ_0044516是否通过靶向调节miR-1281在EC中发挥调节作用还未有报道。 目的：分析Circ_0044516在EC中的表达模式，采用细胞实验探究Circ_0044516在EC细胞促癌表型发展中的作用，同时构建Circ_0044516/miR-1281调控网络，探讨Circ_0044516调控EC发展机制，为EC分子治疗提供新发展思路。 方法：（1）收集2019年5月至2020年5月于长江大学附属第一医院接受食管切除术的39例食管癌患者的癌组织及相应的癌旁组织， qRT-PCR法检测组织中Circ_0044516的表达量，分析Circ_0044516与食管癌患者3年生存率的关系。 （2）选取人正常食管鳞状细胞(HEEC)和食管癌Eca109细胞株，qRT-PCR法检测细胞中Circ_0044516含量。qRT-PCR法检测Circ_0044516在Eca109细胞中的定位，随后运用RNase R与放线菌素D实验检测Circ_0044516的稳定性。 （3）构建Circ_0044516小干扰RNA(siRNA)（si-Circ_0044516）及正常对照（si-NC），转染后qRT-PCR验证转染效率，随后进行功能丧失实验。CCK-8法、克隆形成实验和EdU实验检测细胞增殖；应用流式细胞术测定细胞周期及凋亡；Western blot法检测细胞中凋亡相关蛋白cleaved-caspase3和cleaved-caspase9的表达；划痕实验和Transwell法分别检测细胞迁移和侵袭；小管生成实验检测细胞血管生成能力。 （4）采用Circular RNA Interactome预测软件预测Circ_0044516下游靶向微小RNAs（ microRNA,miRNA）。双荧光素酶报告基因实验验证 Circ_0044516与miR-1281的靶向关系。 （5）qRT-PCR法检测miR-1281在食管癌组织、Eca109细胞及相应正常对照中的含量。设计miR-1281模拟物（miR-1281）及相应对照（miR-NC），qRT-PCR验证转染效率。CCK-8法、克隆形成实验和EdU实验检测细胞增殖；应用流式细胞术检测细胞周期及凋亡；Western blot法检测细胞中凋亡相关蛋白cleaved-caspase3和cleaved-caspase9的表达；划痕实验和Transwell法分别检测细胞迁移和侵袭；小管生成实验检测细胞血管生成能力。 （6）设计miR-1281抑制剂（anti-miR-1281）及相应对照（anti-miR-NC）， qRT-PCR验证转染效率。Eca109细胞分别转染 si-NC, si-Circ_0044516, si-Circ_0044516+anti-miR-NC和 si-Circ_0044516+anti-miR-1281，随后应用上述方法进行回复实验检测Circ_0044516/miR-1281轴对Eca109细胞生长、迁移及侵袭的影响。 （7）构建Circ_0044516短发夹RNA(shRNA)（sh-Circ_0044516）及相应对照（sh-NC），将稳定转染sh-Circ_0044516或sh-NC慢病毒质粒的Eca109细胞皮下注射到裸鼠体内构建体内小鼠食管癌模型。称为sh-Circ_0044516组、sh-NC组。为探讨miR-1281含量变化是否影响Circ_0044516的表达，在注射后第七天，瘤内注射miR-1281拮抗剂，每周两次，为sh-Circ_0044516+anti-miR-1281组。每7天测量一次肿瘤大小，在第28天，通过过量戊巴比妥钠对所有小鼠实施安乐死，分离异种移植瘤并称重。qRT-PCR分析移植瘤中Circ_0044516及miR-1281的含量表达，采用免疫组化技术（IHC）检测移植瘤中Ki67蛋白表达。 结果：（1）qRT-PCR结果显示，相对于癌旁组织，Circ_0044516在食管癌组织中高表达，且高表达的Circ_0044516与食管癌患者不良预后有关。 （2）qRT-PCR结果显示， Circ_0044516的表达含量相对正常细胞在Eca109细胞中显着升高。Circ_0044516主要分布于细胞质中，且可以抵抗RNase R或放线菌素D的降解。 （3）相对于si-NC转染，Eca109细胞转染si-Circ_0044516后，细胞中Circ_0044516含量显着降低。实验结果显示，相对于si-NC组，Circ_0044516下调抑制细胞活性、细胞克隆能力以及DNA合成活性；流式细胞术显示si-Circ_0044516转染抑制细胞周期进展，促进细胞凋亡；蛋白cleaved-caspase3和cleaved-caspase9的表达水平随着Circ_0044516下调显着升高；迁徙和转移的细胞数量以及细胞血管生成能力在si-Circ_0044516组显着降低。 （4）miR-1281被预测含有Circ_0044516的互补序列，随后双荧光素酶报告基因实验验证miR-1281是Circ_0044516靶基因。 （5）qRT-PCR结果显示，相较于癌旁组织和正常细胞系，miR-1281在食管癌组织及细胞中低表达。相对于miR-NC转染，miR-1281模拟物转染显着升高Eca109细胞中的miR-1281含量。进一步过表达实验证实，上调Eca109细胞miR-1281的含量能显着抑制细胞增殖和周期进展，促进细胞凋亡、使蛋白cleaved-caspase3和cleaved-caspase9的表达水平上调。对比miR-NC组，miR-1281组细胞迁移及侵袭数量减少，细胞小管生成能力受到抑制。 （6）qRT-PCR结果显示相对于anti-miR-NC组，anti-miR-1281组Eca109细胞中miR-1281含量明显下降。进一步回复实验结果显示，si-Circ_0044516可介导Ec109细胞增殖抑制、周期阻滞、凋亡增强、cleaved-caspase3和cleaved-caspase9含量升高、细胞迁移及侵袭抑制、小管生成能力减弱。而anti-miR-1281可以逆转这一效应。 （7）与sh-NC组相比，sh-Circ_0044516组肿瘤体积和重量明显减小。Sh-Circ_0044516组瘤内Circ_0044516含量减少，miR-1281含量增多，IHC结果显示Ki67蛋白含量降低。相较于sh-NC组，sh-Circ_0044516+anti-miR-1281组瘤内miR-1281含量增加。相较于sh-Circ_0044516组，sh-Circ_0044516+anti-miR-1281组肿瘤体积和重量变大，且瘤内miR-1281含量降低，Ki67蛋白含量升高。但两组瘤内Circ_0044516含量无明显差异。 结论：Circ_0044516直接靶向miR-1281，干扰Circ_0044516可通过升高食管癌细胞中miR-1281的含量抑制细胞增殖、迁移、侵袭、血管形成以及促进细胞凋亡。
食管癌;发病机制;环状RNA;细胞增殖
长江大学
硕士
基础医学
彭小春
2022
中文
R735.1;R730.2
2023-10-26（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）