谷胱甘肽过氧化物酶在单增李斯特菌抗氧化应激中的作用机制研究
单核细胞增生性李斯特菌（Listeriamonocytogenes，LM，简称单增李斯特菌）为一种革兰氏阳性杆菌，生理特性表现为兼性厌氧且不产生芽孢。LM是一种可感染人和动物的食源性病原体，常随污染的食品经胃肠道进入宿主体内，进而完成从腐生菌到病原菌的蜕变。但LM感染宿主的整个过程并非一帆风顺，其前提是需要应对在环境中与宿主内遭遇到的各种不良应激，如酸应激、渗透压应激、氧化应激等。LM的感染宿主主要是老人、孕妇、婴幼儿等免疫力较低者，感染后即引起李斯特菌病，该病的典型症状为流产、败血症、脑膜炎甚至死亡，虽然发病率低但致死率却高于其他食源性病原菌。 病原菌在宿主内与环境中的生存能力取决于细菌对宿主中活性物质如活性氧、活性氮和活性碳以及其他氧化还原应激因素的防御能力，而抵御氧化伤害的关键是需要使细胞内促氧化剂和抗氧化应激源二者的含量保持动态平衡状态，以及修复和清除受损DNA和蛋白质。为了避免因氧化应激而引起损伤，LM拥有多种非酶促和酶促的抗氧化防御系统，它们共同保护细胞免受氧化应激的伤害。LM中经典的酶促抗氧化系统由谷胱甘肽还原酶（GR）、过氧化氢酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽S转移酶（GST）和硫氧还蛋白（Trx）组成。谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）是真核生物内具有抗氧化功能的一类酶，其主要作用是对抗过氧化氢及有机过氧化物引起的氧化应激，在原核生物中的研究较少。有研究表明GSH-Px在不同细菌中广泛分布，这说明GSH-Px或许在原核生物中的抗逆性和细菌毒力等方面也起着重要作用。本研究的主要目的：（1）构建gsh-px基因缺失株及回补株，研究gsh-px基因在LM抗氧化应激中的作用；（2）研究gsh-px基因在LM致病性中的作用；（3）筛选gsh-px调控因子，探索该调控因子调控gsh-px的分子机制。 1.gsh-px在LM抗氧化应激中的作用 通过同源重组技术将gsh-px基因从临床分离株Lm850658中成功敲除后构建缺失株（Δgsh-px），在缺失株的基础上利用回补质粒将该基因回补进而构建回补株（CΔgsh-px）。通过比较亲本株和缺失株在不同H2O2浓度下的生长曲线发现：不论是在正常条件下（0mM），还是在低浓度（10mM）或者高浓度（40mM）的H2O2处理下，缺失株与亲本株的生长趋势保持一致，说明该基因的敲除不影响LM的生长，也不响应H2O2产生的氧化应激。氧化应激存活试验表明，在10mMH2O2产生的氧化应激条件下，gsh-px缺失株的存活率与亲本株无明显差异；在10mMFe3+和5mMCu2+条件下，gsh-px缺失株的存活率显著高于亲本株。通过测量LM中谷胱甘肽（GSH）的浓度发现，H2O2处理组LM中的GSH含量与对照组之间没有差异，而经金属离子处理后的LM中GSH的含量显著高于对照组；除此之外，gsh-px缺失株中GSH的含量显著高于亲本株，而回补株中GSH的水平与亲本株持平，说明gsh-px通过影响GSH的浓度从而参与LM的抗氧化应激作用。 2.gsh-px基因在LM致病性中的作用 利用细胞试验和动物试验去探索gsh-px在LM致病性中的作用。在细胞粘附侵袭试验中，gsh-px缺失显著增强LM对Caco-2细胞的粘附与侵袭能力；除此之外，在RAW264.7细胞试验中，gsh-px缺失还增强了LM抗巨噬细胞吞噬的能力。由小鼠试验发现，在腹腔注射细菌48h后，缺失株感染组小鼠的肝脾脑载菌量明显比野生株感染组高；小鼠存活试验同样表明，缺失株感染组死亡小鼠多于亲本株。鸡胚试验结果与小鼠试验一致。Westernblot结果显示，缺失株中InlA、InlB、LLO等毒力因子的表达显著高于亲本株，说明gsh-px的缺失对LM的毒力产生影响，并且是通过增加InlA、InlB及LLO等毒力因子的表达量从而增强毒力和致病性。 3.调控因子调控gsh-px的分子机制 为了探索gsh-px参与LM抗氧化应激及致病性的分子机制，本研究构建了gsh-px的GFP报告质粒（Pgsh-px-gfp），该报告质粒可在亲本株Lm850658及10403S中成功表达。将该报告质粒电转入实验室前期构建的14对双元调控系统缺失株中，发现在kdpE/kdpD缺失株中该报告基因的荧光强度显著高于亲本株,提示kdpE/kdpD参与负调控gsh-px的表达。进一步获得了原核表达的KdpE，然后将纯化蛋白KdpE与gsh-px的启动子Pgsh-px进行EMSA试验，结果表明KdpE不能和Pgsh-px直接结合。提示KdpE并非直接调控gsh-px介导LM的抗氧化应激作用与致病性。 综上，本研究发现LM中的GSH-Px通过影响GSH的浓度进而影响其抗氧化应激作用，并且通过增加InlA、InlB及LLO等毒力因子的表达量增强其致病作用；双元调控系统kdpE/kdpD介导负调控gsh-px的表达，但却不是和gsh-px的启动子Pgsh-px直接结合发挥作用。上述试验结果为进一步探究GSH-Px在原核生物中的作用奠定了基础。
单增李斯特菌;谷胱甘肽过氧化物酶;氧化应激;致病性;分子机制
长江大学
硕士
微生物学
杨玉莹;方春
2023
中文
Q936
2023-11-01（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）