多酚与氯己定结合构建多功能非材料依赖性涂层用于医用材料表面改性的研究
目的： 制备一种应用于医疗器械表面的高效、多功能涂层，赋予其抗菌和二次改性能力。通过简单地将天然的褐藻多酚和正电性药物——氯己定混合，以开发一种不依赖于材料的多功能涂层，使得该涂层具有快速的包覆率、高载药效率和良好的生理稳定性，并通过实验证明该涂层具有良好的抗菌、生物相容性和成骨性能，以及二次改性的潜力。 方法: 1.PL@CHX涂层的的制备与对其理化性质的表征：采用液相沉积法制备该涂层后，应用扫描电子显微镜（FE-SEM）、水接触角（WCA）检测、原子力显微镜（AFM）、X射线光电子能谱（XPS）、溶液Zeta电位检测、表面膜Zeta电位检测、衰减全反射-傅里叶变换红外光谱（ATR-FTIR）、石英晶体微天平与耗散监测（QCM-D）进行评价。 2.PL@CHX涂层的抗菌性能评价：应用浊度法、抑菌环法和涂布平板法进行体外评价；体内分析抑菌能力则通过将制备了PL@CHX涂层的钛棒样品植入SD大鼠股骨骨髓腔，于1天和1周后取出从涂层表面分离细菌与空白对照组钛棒进行菌悬液中活性菌的数量比较。 3.PL@CHX涂层的稳定性评价：将成功制备涂层的钛片分别在PBS中浸泡1天、7天、14天、21天、28天、35天、42天、49天和56天后摄SEM照片和进行抗菌能力评价以衡量其结构稳定性和抗菌稳定性。 4.PL@CHX涂层的生物相容性评价：使用MC3T3-E1前成骨细胞和SD大鼠骨髓间充质干细胞进行细胞培养，研究PL@CHX涂层对体外细胞粘附的影响。通过与CHX最低抑菌浓度（MIC组）进一步评价其抗菌效果以及生物毒性。通过金黄色葡萄球菌预先定植并形成生物膜后与MC3T3-E1细胞共培养评价涂层发挥抗菌能力时的细胞相容性。 5.PL@CHX涂层的体内效果评价：采用SD大鼠股骨外侧髁螺钉植入模型，摄CT片后，在植入4周和8周后处死收集股骨，经Micro-CT扫描样品，制做硬组织切片。苏木精-伊红（HE）染色和甲苯胺蓝染色用于评价体内抗菌及成骨效果。 6.PL@CHX涂层的非材料依赖性评价：采用液相沉积法在多种材料表面制备PL@CHX涂层，使用WCA以及SEM评价涂层情况。 7．PL@CHX涂层的转录组测序：通过RNA测序研究Control组和PL@CHX的功能基因分布特征，挑选出成骨相关基因进行PCR反应，初步探究其体内成骨作用。 结果： 1.PL@CHX涂层的理化表征 采用液相沉积法在钛片表面制备PL@CHX涂层。SEM结果显示，空白钛片表面粗糙呈现鳞片状；与空白钛片（Control组）相比，在PL组观察到钛片基体的片状粗糙度略有降低；而PL@CHX钛片组表面粗糙度模糊，并且在其表面形成了新的颗粒物质。AFM对于其表面的粗糙程度变化的结果也与上述SEM的结果保持一致。水接触角结果显示与空白钛片（53.47°）相比，PL组的接触角（19.20°）显著降低，且随着CHX浓度的增加，PL@CHX组的水接触角值逐渐增大。ATR-FTIR光谱显示，多酚原有官能团基本不变。XPS分析表明，与空白对照组Ti相比，实验组Ti峰消失，N峰增加，出现Cl峰。这些结果清晰地表明，PL@CHX涂层成功地制备到了钛片表面。对于PL和CHX混合溶液进行Zeta电位的检测，其结果显示，在加入CHX溶液后，带负电荷的PL溶液的电位逐渐增大。由PL的zeta电位（-48.612mV）逐渐攀升至8.93mV，且PL@CHX组的zeta电位值也随着CHX浓度的增加而增大。结合涂层表面膜电位的结果可以证明在钛片表面制备PL涂层后其膜电位呈负增长，但制备PL@CHX涂层后的钛片表面负电荷减少。且随着PL@CHX组中CHX浓度的增加，钛片表面膜电位由负电荷逐渐接近中性，说明涂层中带正电的CHX成分逐渐增加。 2.PL@CHX涂层的体内外抗菌性能 我们选择金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus,S.aureus)和大肠杆菌（Escherichiacoli,E.coli）作为模型菌，因为其分别代表为革兰氏阳性菌与革兰氏阴性菌。为了验证制备的涂层的抗菌性能，我们分别对Control组、PL组和PL@CHX组进行了菌液比浊法实验，涂布平板实验和抑菌环实验。比浊法结果显示，Control组和PL组的钛片在加入细菌悬液孵育12小时后仍呈浑浊状态，而PL@CHX组的钛片溶液则是清澈的。吸光度结果可验证对照组和PL组的OD值均显著高于PL@CHX组。PL@CHX组的琼脂板涂板结果显示无金葡菌和大肠杆菌的生长，而无Chx的两组琼脂板上的细菌正常生长。抑菌环实验结果显示Control组和PL组的钛片周围没有形成抑菌环，而PL@CHX组的钛片周围有明显的抑菌环，并且观察到CHX含量越高，抑菌环直径越大。 体内实验也显示出与体外实验相同的结果：将PL@CHX组和Control组的钛棒分别植入雄性SD大鼠股骨骨髓腔1天和7天，观察到所有伤口愈合良好，无化脓性分泌物或其他明显炎症。解剖股骨后，取出钛棒压在琼脂板上观察细菌的分布和数量。结果表明，PL@CHX组附着在钛棒上的细菌数量远少于Control组。钛棒上的细菌悬液培养结果显示相同结果。 为了评价PL@CHX涂层抗菌性能的稳定性，将制备的涂层钛片在浸泡0天、7天、14天、21天、28天、35天、42天、49天和56天后进行菌液比浊实验、涂布平板实验和抑菌环实验。结果显示PL@CHX实验组具有稳定而明显的抑菌效果。即使在PBS溶液中浸泡8周后，实验组（PL@CHX）的抑菌环仍然出现。综上所述，PL@CHX不仅在体外具有良好和稳定的抗菌能力，而且在体内也具有相当不错的抗菌效果。 3.PL@CHX涂层的生物学评价 采用MTT比色法，CCK-8检测法和荧光染色探究PL@CHX涂层对细胞活力和增殖的影响。我们发现不同CHX浓度的PL@CHX组与空白Ti（Control组）相比，MC3T3-E1前成骨细胞的生长和增殖无明显差异。荧光染色结果进一步显示，PL@CHX-Ti表面的MC3T3-E1细胞呈多边形形状，充分展开，有部分丝状足，细胞骨架呈丝状排列，方向一致。从细菌细胞共培养的荧光染色结果也可以看出，Control组和PL组的细胞被完全污染，在细菌的干扰下无法生长，但PL@CHX-Ti抗菌的同时，其表面细胞生长状态仍良好。无论MC3T3-E1细胞还是骨髓间充质干细胞（BMSCs），PL@CHX涂层对细胞增殖和粘附均无不良影响。CCK-8与荧光染色结果也显示，PL@CHX组的细胞数量远高于CHX溶液MIC组。进一步证明，PL@CHX涂层相较于纯CHX溶液，进一步提高了其细胞相容性，使其能够在种植体表面发挥良好的抗菌性能，具有良好的细胞相容性。 4.钛钉表面PL@CHX涂层的体内效果评价 通过Micro-CT分析评估各组的三维成骨情况，实验组Ti螺钉骨体积/组织体积百分比，骨体积和组织体积比（BV/TV）等周围骨整合指标明显高于空白对照组。我们用甲苯胺蓝和碱性品红染色评估新形成的种植体周围骨组织，结果显示，PL@CHX组钛钉的骨融合程度优于空白对照组，新生骨结合更多，周围无炎症组织浸润。 5.PL@CHX涂层的非材料依赖性评价 为了确定我们的PL@CHX涂层可以应用于其他基质，我们在几种典型的材料基质上进行了涂层，包括常见的有机聚合物PET膜，PTFE膜，硅片，金片，铜箔，不锈钢，铝箔，尼龙膜，玻璃和硝酸纤维素膜。涂料制备前后可以看到制备前的材料是透明、白色或呈金属的天然颜色的，制备后的涂层使原有的表面变粗糙且颜色逐渐暗淡。从扫描电镜可以观察到涂层制备后，多孔材料（尼龙）的孔隙几乎消失，大量颗粒状物质附着在其上。表面光滑的金属和材料可以看到有大量的颗粒物质附着。水接触角分析结果表明，PL@CHX涂层对PTFE等疏水表面也会有粘附作用。 6.PL@CHX涂层诱导MC3T3-E1细胞成骨分化的能力 将MC3T3-E1在钛片制备涂层面培养五天后通过RNA测序研究Control组和PL@CHX的功能基因分布特征。随后我们通过对MC3T3-E1进行成骨分化诱导并在诱导第7天时进行成骨相关基因的mRNA水平检测，RUNX2，OSX（成骨主要调节因子）水平的明显提升。 结论: 本研究成功地开发了一种基于静电结合和cation-π组装的多功能转化涂层。作为一种带负电荷的多功能表面改性剂——PL通过与带有强正电荷的CHX结合形成长期稳定的抗菌PL@CHX涂层。为种植体周围炎等疾病的临床治疗提供了新的解决方案和思路。
医用材料;表面改性;多功能涂层;褐藻多酚;氯己定;抗菌性能;生物相容性;成骨作用
安徽医科大学
硕士
口腔基础医学
李向阳
2023
中文
R318.08
2023-10-25（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）