何首乌饮通过调节DNA-RNA表观遗传串扰延缓“肾精亏虚”大鼠睾丸支持细胞衰老
目的： 探讨何首乌饮调控 DNA-RNA 表观遗传串扰延缓“肾精亏虚”雄性大鼠睾丸组织和支持细胞衰老机制。 方法： 1“肾精亏虚”大鼠衰老模型建立及鉴定 1.1 使用电针疗仪以单因素电刺激法模拟“房劳”+“惊恐”构建“肾精亏虚”大鼠衰老模型。 1.2 结合睾丸组织 β-半乳糖苷酶衰老染色、P16 蛋白免疫组化，鉴定衰老模型。 2 测序数据生物信息学分析 2.1 甲基化芯片（MeDIP-chip）数据分析。使用 Ringo，limma 和 MEDM，以青年组为对照，分别获取衰老组和何首乌饮组大鼠睾丸组织的差异甲基化基因。 2.2 RNA测序（RNA-seq）测序数据分析。使用 limma 获取青年组、衰老组和何首乌饮组差异表达基因。 2.3 RNA 免疫沉淀后测序（ MeRIP-seq ）数据分析。使用 exomePeak 和clusterProfiler 获取青年组、衰老组和何首乌饮组差异峰基因及其 GO/KEGG 信号通路分布及生物功能覆盖。 3 体内实验，验证测序数据分析结果 3.1 验证 DNMT1 受何首乌饮调控。RT-qPCR 和 Western Blot 检测睾丸组织DNMT1 表达改变情况。 3.2 验证 MeDIP-chip 及 RNA-seq 数据分析结论。RT-qPCR 和 Western Blot 检测睾丸组织 METTL3、FTO 和 IGF2BP1 的表达情况。MSP 检测 Mettl3, Fto 和Igf2bp1 启动子区域甲基化情况。 3.3 验证 MeRIP-seq 数据分析结果。MeRIP-qPCR 检测睾丸组织 P53 和 P16 RNA 甲基化情况，RT-qPCR 和 Western Blot 检测 P53 和 P16 表达。 4 大鼠睾丸支持细胞衰老模型建立及鉴定 4.1 芬顿试剂处理 F3 代睾丸支持细胞建立细胞衰老模型。通过 β-Gal 染色和流式细胞术检测细胞周期，鉴定细胞衰老模型。 4.2 慢病毒转染敲低支持细胞 Dnmt1 基因，RT-qPCR、Western Blot 检测支持细胞中 DNMT1 表达水平，鉴定慢病毒敲低效率。 5 体外实验，机制探讨 5.1 β-Gal 染色和流式细胞术检测细胞衰老及周期阻滞情况及 DNMT1 敲低后细胞衰老情况及何首乌饮含药血清的作用。 5.2 MSP 检测 Mettl3、Fto 和 Igf2bp1 启动子区域甲基化情况，及何首乌饮对其的影响。 5.3 RT-qPCR、Western Blot 检测 METTL3、FTO 和 IGF2BP1 mRNA 和蛋白表达情况及何首乌饮治疗后的作用，以及衰老相关基因 P53 和 P16 表达情况。 5.4 MeRIP-qPCR 检测衰老相关基因 P53 和 P16 mRNA m6A 修饰情况。 结果： 1 大鼠衰老模型鉴定，相对于青年组，衰老组 β-Gal 阳性细胞率明显增加（P＜0.01），P16 IHC 评分升高（P＜0.05），何首乌饮干预后，睾丸组织 β-Gal 阳性细胞率显著减少（P＜0.05），P16 IHC 评分降低（P＜0.05）。 2 对测序数据进行生物信息学分析 2.1 MeDIP-chip 数据分析，相较于青年组，在衰老组中 Mettl3 和 Igf2bp1 启动子区域甲基化程度低，Fto 甲基化程度高，何首乌饮干预后 Mettl3 和 Igf2bp1 启动子区域甲基化程度升高，Fto 甲基化程度降低。 2.2 RNA-seq 数据分析，相对与青年组，衰老组睾丸组织中，RNA 甲基化基因METTL3 和 IGF2BP1 表达上调，FTO 表达下调。 2.3 MeRIP-seq 数据分析，以青年组为对照，获取衰老组差异甲基化峰基因并绘制火山图，可见差异甲基化 RNA 包含 Tp53、Cdkn2a、Mtor 和 Becn1 等。所得差异基因进行 GO/KEGG 分析，衰老组和何首乌饮组共同富集通路包含细胞周期、mRNA 运输、mRNA 稳定性、Wnt 信号通路和mTOR 信号通路。 3 体内实验，验证测序数据分析结果 3.1 睾丸组织 DNMT1 RT-qPCR 和 Western Blot 结果，相对青年组，衰老组DNMT1 mRNA 和蛋白表达量明显下降（P＜0.001），何首乌饮干预后，DNMT1 mRNA和蛋白表达量均有所回升（P＜0.05）。 3.2 睾丸组织 METTL3、FTO 和 IGF2BP1 MSP 结果，对比青年组，衰老组METTL3 和 IGF2BP1 启动子区域甲基化程度明显降低（P＜0.001），FTO 甲基化升高（P＜0.001），何首乌饮干预后 METTL3 和 IGF2BP 启动子区域甲基化增加（P＜0.05），FTO 甲基化下降（P＜0.05）。 3.3 睾丸组织 METTL3、FTO 和 IGF2BP1 RT-qPCR 和 Western Blot 结果，相较青年组，衰老组中 METTL3 和 IGF2BP1 mRNA 和蛋白表达量升高（P＜0.001），FTO表达减少。何首乌饮干预后 METTL3 和 IGF2BP1 mRNA 和蛋白表达量降低，FTO 表达增加（P＜0.01）。 3.4 睾丸组织 P53、P16 MeRIP-qPCR、RT-qPCR 和 Western Blot 结果，相对于青年组，衰老组睾丸组织 P16 和 P53 mRNA m6A 修饰明显增加（P＜0.01），mRNA 和蛋白表达量增加。何首乌饮干预后 P16 和 P53 m6A 修饰减少（P＜0.05），两者 mRNA和蛋白表达量降低。 4 睾丸支持细胞衰老模型鉴定 4.1 β-Gal 染色和细胞周期检测结果，相较于对照组，衰老组蓝染阳性细胞比率增大，且细胞周期出现 G1/S 期阻滞（P＜0.01）。两者结合表明支持细胞衰老模型建立成功。何首乌饮含药血清作用后蓝染阳性细胞比率下降，G1/S 期阻滞缓解（P＜0.05）。 4.2 睾丸支持细胞慢病毒转染结果，转染 24h 的 GFP 绿色荧光强度高，且RT-qPCR 和 Western Blot 结果表明转染后 DNMT1 表达量明显下降（P＜0.05）。 5 体外实验，机制探讨 5.1 DNMT1 敲低睾丸支持细胞 Mettl3、Fto 和 Igf2bp1 MSP结果，相较对照组，衰老组中 METTL3 和 IGF2BP1 启动子区域甲基化程度降低，FTO 甲基化升高，何首乌饮含药血清处理后 METTL3 和 IGF2BP1甲基化程度升高，FTO 甲基化下降（P＜0.01）。相较于空载组，shDNMT1 组中 METTL3 和 IGF2BP1 甲基化程度降低，FTO甲基化升高（P＜0.05），shDNMT1+何首乌饮组中各基因甲基化程度未有明显改变。 5.2 DNMT1 敲低睾丸支持细胞 METTL3、FTO 和 IGF2BP1 RT-qPCR 和Western Blot 结果，相对于对照组，衰老组中 METTL3、IGF2BP1 mRNA 表达量明显增加，FTO 表达减少，何首乌饮组 METTL3、IGF2BP1 mRNA 表达量降低，FTO 表达增加（P＜0.05），蛋白表达趋势与 mRNA 表达趋势一致；相较于空载组，shDNMT1组 METTL3、IGF2BP1 和 FTO mRNA 和蛋白表达升高， shDNMT1+何首乌饮组METTL3、IGF2BP1 和 FTO mRNA 及蛋白表达未发生明显改变。 5.3 DNMT1 敲低睾丸支持细胞 P53、P16 MeRIP-qPCR 结果，相较于对照组，P53、P16 mRNA m6A 修饰程度在衰老组中均升高，且 mRNA 表达增加，何首乌饮组 P53、P16 mRNA m6A 修饰增加，mRNA 表达下降（P＜0.05）；相较于空载组，shDNMT1 组m6A 修饰增加，mRNA 表达增加（P＜0.05）。shDNMT1+何首乌饮组 P53、P16 mRNA m6A 修饰和 mRNA 表达无明显改变。 结论： 1 何首乌饮可以降低 Mettl3 和 Igf2bp1 基因启动子区域甲基化，提升 Fto 基因启动子区域甲基化。 2 何首乌饮可以通过调节 P53、P16 RNA 甲基化水平延缓睾丸支持细胞衰老。 3 何首乌饮可通过影响 Dnmt1、Metttl3、Fto 和 Igf2bp1 的表达，参与 DNA-RNA表观修饰串扰延缓“肾精亏虚”衰老大鼠睾丸支持细胞衰老。
何首乌饮;表观遗传学;睾丸组织;支持细胞;衰老调控
河北大学
硕士
基础医学
牛嗣云
2022
中文
R285.5
2023-09-12（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）