CMTM6通过稳定PD-L1影响iNKT细胞抗HCC的实验研究
目的: 肝细胞癌(HCC)所形成的肝脏免疫抑制性微环境严重影响着肿瘤免疫疗法的治疗效果.解除免疫抑制,恢复免疫细胞的抗肿瘤功能已成为HCC免疫治疗的重要策略.近来研究表明,恒定自然杀伤 T 细胞(iNKT)在识别肿瘤抗原的过程中不受主要组织相容性复合体I类分子下调的影响,表现出较传统T细胞更具优势的抗肿瘤效应.趋化素样因子超家族成员6(CMTM6)是调控肿瘤细胞表面PD-L1分子的关键因子,其通过稳定程序性死亡配体1(PD-L1)增强免疫检查点的抑制功能.研究发现,抑制CMTM6的表达可明显促进T细胞的抗肿瘤活性,但对于能否增强iNKT细胞活化及功能尚不清楚.本课题旨在研究肝癌组织CMTM6的表达是否影响iNKT细胞向肿瘤组织的浸润;抑制CMTM6的表达能否通过PD-1/PD-L1信号轴增强iNKT细胞的活化及功能,进而影响抗HCC功能. 方法: 1. 生物信息学分析CMTM6的功能、与其互作的蛋白质和对预后的影响 2. 人原发性肝癌石蜡组织切片研究 免疫组化对HCC肿瘤组织和癌旁组织CMTM6、PD-1、PD-L1的表达情况进行定位、定性、定量分析;双重免疫组化对iNKT细胞(CD3+CD56+)的表达情况进行定位、定性、定量分析.X2检验分析CMTM6与PD-1、PD-L1和iNKT细胞之间的相关性,结合多重荧光免疫组化或(和)TNMplot数据库进行验证.在组织层面初步明确CMTM6与PD-L1、PD-1和iNKT细胞之间的相关性,为后续机制探讨奠定基础. 3. 高表达CMTM6细胞株的筛选及鉴定 Western Blot筛选高表达CMTM6的肝癌细胞株,经转染处理抑制CMTM6的表达,荧光显微镜及Western Blot验证转染成功. 4. iNKT细胞的纯化及功能鉴定 收集健康献血员的白细胞滤器,免疫磁珠分选技术(MACS)获取iNKT细胞.流式细胞术(FCM)检测分选前和纯化后iNKT细胞的频率并进行功能验证. 5. 细胞学实验 质粒转染低表达CMTM6后,将HepG2细胞与iNKT细胞共培养:FCM检测该体系中iNKT细胞PD-1和HepG2细胞PD-L1的表达情况.酶联免疫吸附试验(ELISA)检测共培养上清IFN-γ、IL-4、Perforin、Granzyme B的分泌情况.细胞增殖、克隆形成、划痕实验及杀伤(细胞毒)实验观察CMTM6能否影响iNKT细胞抗肿瘤功能.探讨抑制CMTM6的表达能否解除PD-1/PD-L1免疫检查点抑制,促进iNKT细胞活化,提高抗HCC功能. 结果: 1. PD-L1与CMTM6基因相似,已有文献报道二者存在直接的功能关联.CMTM6主要定位于膜上,参与内吞循环、内体转运、蛋白质稳定性调节.CMTM6的表达与预后呈负相关(P＜0.05). 2. HCC患者CMTM6、PD-L1和PD-1在肿瘤组织中高表达(P＜0.01).CMTM6分别与PD-L1、PD-1的表达呈正相关(P＜0.01).iNKT细胞在肿瘤组织中浸润减低,PD-1表达上调(P＜0.01).CMTM6高表达抑制iNKT细胞的浸润(P＜0.05). 3. HepG2细胞株中高水平表达CMTM6.低表达CMTM6 48h后,荧光显微镜观察可见大量绿色荧光,CMTM6蛋白表达水平下调,与此同时PD-L1蛋白表达水平也随之下调(P＜0.01). 4. 外周血iNKT细胞频率约占淋巴细胞总频率的(0.25±0.09)%,MACS分选后iNKT细胞纯度可达95%以上.活化后以IFN-γ+ iNKT细胞为主. 5. HepG2细胞与iNKT细胞共培养,可促使肿瘤细胞诱导型PD-L1和iNKT细胞诱导型PD-1的表达上调;CMTM6低表达后,肿瘤细胞PD-L1和iNKT细胞PD-1的表达水平相对降低(Plt;0.05);同时使共培养上清中IFN-γ、Perforin、Granzyme B分泌增加(Plt;0.05),IL-4分泌降低(Pgt;0.05).此外CMTM6低表达可进一步增强iNKT细胞的杀伤能力,进一步抑制HepG2细胞的增殖、侵袭和迁移(Plt;0.05). 结论: 1. CMTM6在HCC肿瘤组织中高表达,癌旁组织中低表达. 2. 低表达CMTM6可通过抑制PD-1/PD-L1信号轴促进iNKT细胞活化,增强抗HCC功能. 3. CMTM6可作为缓解PD-1/PD-L1抑制剂耐药的新靶点,与iNKT细胞过继免疫治疗联合应用,有望成为一种新的提高抗肿瘤疗效的策略.
原发性肝癌;免疫疗法;趋化素样因子超家族成员6;程序性死亡配体1;恒定自然杀伤T细胞;抗肿瘤功能
河北大学
硕士
基础医学
孟明
2022
中文
R735.7;R730.51
2023-09-12（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）