不同海拔环境下多刺绿绒蒿黄酮类合成途径及关键基因功能分析
多刺绿绒蒿（Meconopsis horridula Hook.f.amp;Thoms.）是罂粟科绿绒蒿属一年生草本植物，生长于海拔3600-5100米的青藏高原地区，是我国传统藏医药中的常用药材。目前有关多刺绿绒蒿的研究多集中在资源调查、分子鉴定、化学成分分析和药理研究等方面，而对于多刺绿绒蒿的环境适应性机制、次生代谢合成以及相关基因的挖掘研究相对较少。黄酮类化合物是多刺绿绒蒿中重要的次生代谢产物，在多刺绿绒蒿生长发育过程和响应环境变化中发挥着重要作用，同时也是多刺绿绒蒿中主要的药用成分之一。面对多刺绿绒蒿野生资源枯竭、资源保护及药用价值开发利用等问题，迫切的需要整合现代组学技术及分子生物学实验方法开展全面的基础性研究，促进多刺绿绒蒿的可持续利用，并为多刺绿绒蒿黄酮类物质的生物合成机制的深入研究和适应高原极端环境的分子进化研究提供基础数据。 本研究于2020年采集不同海拔的多刺绿绒蒿为研究对象（东德措：4872 m、达群村：4925 m和夺底沟：3980 m），运用转录组和代谢组方法对不同组间差异基因和差异代谢物进行分析，筛选出多刺绿绒蒿黄酮类代谢途径中关键的结构基因查尔酮合成酶（MhCHS）和查尔酮异构酶（MhCHI），并对其理化性质、蛋白结构和分子生物学功能进行初步探究，主要研究结果和结论如下： （1）利用代谢组学对三个不同海拔居群的多刺绿绒蒿进行代谢组学检测与分析，结果显示三个居群间共鉴定到771个代谢物，其中有406个差异代谢物，在植物次生代谢物注释中显示，黄酮类、生物碱类和萜类代谢物数目较多，分别为22个、11个和9个。差异代谢物富集分析结果显示，类黄酮生物合成、黄酮和黄酮醇生物合成、异黄酮生物合成以及花青素生物合成通路被显著富集。 （2）通过转录组测序技术对三个不同居群的多刺绿绒蒿进行转录组分析，共获得60.15 Gb测序数据，组装后共获得75793条Unigene序列，N50平均长度为1637 bp。经过差异分析、数据库注释和富集分析，发现差异基因主要富集在与能量代谢相关的核糖体、柠檬酸循环和糖酵解/糖异生等初生代谢通路，以及细胞色素P450类物质代谢、光合作用--天线蛋白与淀粉和蔗糖代谢等抗逆抗胁迫相关的次生代谢途径，其中黄酮类生物合成途径及上游的苯丙烷生物合成途径也显著富集。 （3）通过共现性网络分析筛选出黄酮类代谢途径关键结构基因，并通过克隆与测序获得多刺绿绒蒿CHS基因和CHI基因序列，对其理化性质和蛋白结构进行了预测分析。多刺绿绒蒿CHS基因（MhCHS）编码390个氨基酸，相对分子质量为42620.18，等电点pI为5.8，不稳地定系数为36.85，平均疏水性为-0.078，为亲水性稳定蛋白。多刺绿绒蒿 CHI 基因（MhCHI）编码 222 个氨基酸，相对分子质量为24763.2，等电点pI为4.67，不稳地定系数为47.10，平均疏水性为-0.101，为亲水性不稳定蛋白。 （4）成功构建pET-28a-MhCHI和pET-28a-MhCHS原核表达载体，并成功转入大肠杆菌BL21当中获得原核表达菌株，以IPTG（异丙基硫代半乳糖苷）为外源诱导剂，于37℃和28℃在大肠杆菌BL21细胞中成功诱导表达出24.76 KD和42.62 KD的目的蛋白。 （5）成功构建pFGC5941-MhCHS和pFGC5941-MhCHI植物过表达载体，通过农杆菌介导的花序浸染法将植物过表达载体转化入野生型拟南芥当中，通过载体抗性筛选和分子验证最终获得T3代稳定遗传的过表达株系，对T3代转基因植株进行总黄酮含量测定，结果显示 pFGC5941-MhCHS 和 pFGC5941-MhCHI 转基因植株总黄酮含量均显著升高。 本研究首次利用转录组和代谢组相结合的现代组学方法分析了多刺绿绒蒿黄酮类生物合成途径，筛选了黄酮类合成途径中的关键结构基因，并对其生物学功能进行了初步分析，为多刺绿绒蒿黄酮类生物合成途径的分子调控机制的深入研究、多刺绿绒黄酮类化合物的开发利用以及多刺绿绒蒿高原适应性进化研究提供了基础数据。
多刺绿绒蒿;黄酮类物质;生物合成机制;转录组;代谢组;基因表达
西藏大学
硕士
生态学
刘星
2023
中文
S567.212.01
2023-09-19（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）