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    Abbreviation index
    Chapter 1. Introduction
    1.1 Colorectal cancer and colitis-associated cancer
    1.1.1 Colorectal cancer
    1.1.2 Colitis-associated cancer
    1.2 Inflammation and colitis-associated cancer
    1.2.1 Inflammatory bowel disease (IBD) and cancer
    1.2.2 Inflammatory factors and pathways
    1.3 Colorectal cancer and gut microbiota
    1.3.1 Gut microbiota and cancer
    1.3.2 Colorectal cancer and metabolites
    1.4 Ginsenosides and Li-Ginseng Powder
    1.4.1 Ginseng and ginsenosides
    1.4.2 Li-Ginseng Powder (LGP)
    1.5 Topic selection and objective
    Chapter 2. LGP ameliorates inflammatory response of the colontissue in AOM/DSS-induced CAC mice
    2.1 Introduction
    2.2 Materials and methods
    2.2.1 Mice
    2.2.2 Solution preparation
    2.2.3 Experimental reagents
    2.2.4 Experimental apparatuses
    2.2.5 Animal experimental design
    2.2.6 Sample collection
    2.2.7 Acquisition of related targets of the main ginsenosides contained in LGP for network pharmacological analysis
    2.2.8 Prediction of gene targets for colitis-associated cancer
    2.2.9 Screening of potential therapeutic targets
    2.2.10 Network diagram of drug-disease PPI and core drug targets
    2.2.11 Gene Ontology (GO) and KEGG enrichment analysis
    2.2.12 Determination of IL-6, TNF-α, IL-1β, and PGE2 levels by ELISAs
    2.2.13 Quantitative Real-Time Polymerase Chain Reaction (qRT-PCR)
    2.2.14 Nitrite assay
    2.2.15 Western blot analysis
    2.2.16 Histopathological analysis
    2.2.17 Statistical analysis
    2.3.1 LGP ameliorates pathological injury and tumorigenesis in AOM/DSS- induced CAC mice
    2.3.2 Identification of LGP core targets against colitis-associated cancer by network pharmacology approach
    2.3.3 Gene Ontology and KEGG pathway enrichment analysis of the target genes of LGP against CAC
    2.3.4 Inflammatory response of the colon tissue by administration of LGP
    2.3.5 Inhibitory effects of LGP on activation of NF-κB and STAT3 in AOM/DSS- induced mice
    2.4 Discussion and conclusion
    Chapter 3. LGP enhance apoptosis and modulate the gut microbiota and metabolites in the AOM/DSS-induced CAC mice
    3.1 Introduction
    3.2.2 Experimental reagents
    3.2.3 Solution preparation
    3.2.4 Experimental apparatuses
    3.2.5 Animal experimental design
    3.2.6 Western blot analysis
    3.2.7 Histopathological analysis
    3.2.8 Immunohistochemistry
    3.2.9 TUNEL method for apoptosis
    3.2.10 Antibiotic treatment of AOM-DSS mice
    3.2.11 Feces collection and 16S rRNA sequence analysis
    3.2.12 Metabolomic analysis
    3.2.13 Correlation analysis of the gut microbiome-serum metabolome
    3.2.14 Statistical analysis
    3.3 Results
    3.3.1 Effects of LGP on apoptosis of the colon tissues in the AOM/DSS-induced CAC mice
    3.3.2 Suppression of tumor cell proliferation
    3.3.3 Antitumor effect of LGP is mediated by the gut microbiota
    3.3.4 Changes of microbial community structure in CAC mice
    3.3.5 LGP alters the metabolism in the AOM/DSS-induced CAC mice
    3.3.6 Correlation analysis of gut microbiota and metabolites
    3.4 Discussion and conclusion
    Chapter 4. Anti-inflammatory mechanism of G-Rh4 based on integrative network pharmacology and experimental verification
    4.1 Introduction
    4.2.2 Solution preparation
    4.2.3 Experimental reagents
    4.2.4 Experimental apparatuses
    4.2.5 Screening of potential therapeutic targets of G-Rh4 against inflammation
    4.2.6 Network diagram of drug-disease PPI
    4.2.7 Gene Ontology (GO) and KEGG enrichment analysis
    4.2.8 Diagram of core drug targets
    4.2.9 Cell culture
    4.2.10 Assay to measure cell viability
    4.2.11 Quantitative Real-Time Polymerase Chain Reaction(qRT-PCR)
    4.2.12 Determination of IL-6, TNF-α, IL-1β, and PGE2 levels by ELISAs
    4.2.13 Nitrite assay
    4.2.14 Western blot analysis
    4.2.15 Statistical analysis
    4.3 Results
    4.3.1 Prediction of G-Rh4 potential target and inflammation-related genes
    4.3.2 Identification of G-Rh4 core targets against inflammation
    4.3.3 Gene Ontology and KEGG pathway enrichment analysis of the target genes of G-Rh4 against inflammation
    4.3.4 Effect of G-Rh4 on the viability of RAW264.7 cells
    4.3.6 Effect of G-Rh4 on the expression of iNOS/COX-2 and NO/ PGE2 production in RAW264.7 cells
    4.3.7 G-Rh4 inhibited the NF-κB and STAT3 activation in LPS-induced RAW264.7 macrophages
    4.4 Discussion and conclusion
    Chapter 5. Conclusion and outlook
    5.1 Conclusion
    5.2 Outlook
    参考文献
    Curriculum vitae
    致谢
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栗参超微粉抑制炎症性结肠癌的作用研究

TO KWANG IL
吉林大学
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引用
结直肠癌（Colorectalcancer,CRC）是全世界第三大常见癌症，其发病率居高不下，每年有超过100万人患上结肠癌。在结肠癌的早期，可以进行手术治疗，然而大多数结肠癌患者早期症状不明显，约25%的患者确诊时已发生转移。炎症性结肠癌（Colitis-associatedcancer,CAC）作为结肠癌的一个亚型，是肠道最常见的恶性肿瘤之一。对炎症性结肠癌的研究表明，饮食习惯、遗传因素、炎症性肠病（IBD）、肠道微生态和其他疾病可能是炎症性结肠癌的主要致癌因素。炎症性肠病（IBD）是一种发生在结直肠的慢性、非特异性炎症病变。与正常人群相比，炎症性肠病患者患结肠癌的风险大约高10~40倍。近年来，炎症性肠病的发病率一直在增加，预计CAC的发病率也会随之上升。　　临床上应用于炎症性结肠癌的药物多为单一靶点，长期使用会产生多种不良反应，且极易产生抗药性。因此，研发新的CAC治疗药物迫在眉睫。中药一般含有多种成分，可作用于多个靶点，并对每个靶点的作用相对温和，具有功效好、毒性低的特征。人参皂苷是人参的主要活性成分，具有抗炎症、抑制癌细胞生长、增强免疫力等多种功效。最近研究表明，肠道菌群的紊乱在结直肠腺瘤和腺癌的发展中起着重要作用，因此有人提出，结肠肿瘤是“与细菌有关的疾病”。许多研究已发现人参中的有效成分可以通过抑制或促进某些细菌的生长和改变肠道菌群的结构来调节肠道微生物的作用。本研究使用的栗参超微粉（Li-GinsengPowder,LGP）是对吉林人参经过特殊加工获得的人参深加工制品，其特征是富含稀有人参皂苷Rh4、Rg3、Rg5、Rk1、Rk3，占皂苷总量的60%。目前人参及其次级代谢产物对肠道菌群的调节作用以及抗炎症、抗肿瘤之间的复杂相互作用机制尚不清楚。　　本文旨在通过网络药理学分析，探究栗参超微粉（LGP）对抗炎症性结肠癌的靶基因与作用途径，并通过炎症性结肠癌动物模型验证LGP的抗肿瘤效果和作用机制，最终阐明LGP通过调节肠道菌群和炎症反应，抑制炎症性结肠癌的作用机制。本研究中我们采用AOM/DSS诱导的小鼠炎症性结肠癌模型研究LGP对CAC的抑制作用。观察到LGP显著抑制AOM/DSS诱导的模型组小鼠体重降低和肿瘤形成。对结肠组织的Hamp;E染色结果显示，LGP的治疗有效抑制AOM/DSS诱导的结肠组织结构的破坏，显示相对完好的隐窝结构。　　为了阐明LGP对炎症性结肠癌的作用机制，本论文通过网络药理学方法预测LGP主要活性成分-稀有人参皂苷群对炎症性结肠癌的靶基因和作用途径。我们得到了348个稀有人参皂苷群的潜在靶点和709个CAC的相关基因，进一步通过交集分析筛选出49个交集基因。通过对交集基因的拓扑分析，筛选出LGP干预CAC的关键基因，包括TNF-?、CASP3、IL-6、STAT3、EGFR等。GeneOntology(GO)分析结果表明，LGP的抗CAC靶点与一氧化氮生物合成过程、炎症反应、细胞增殖、IL-6的表达、细胞凋亡以及NF-κB通路密切相关。此外，通过KyotoEncyclopediaofGenesandGenomes(KEGG)数据库对靶点基因进行了路径富集分析，共同基因主要集中在TNF信号通路、HIF-1信号通路、NF-κB信号通路、炎症性肠病、JAK-STAT信号通路以及细胞凋亡通路的调节过程。根据网络药理学分析结果，我们检测了结肠组织中炎症相关基因表达水平。与模型组相比，LGP给药组中促炎症因子-TNF-α、IL-6、IL-1β和炎症相关酶-iNOS、COX-2的表达均显著降低，并且LGP处理显著降低了结肠组织中NF-κBp50(Ser337)、IκBα(Ser32)和STAT3(Tyr705)的磷酸化水平，这些蛋白质的磷酸化水平在AOM/DSS诱导的模型组的结肠组织中均显著上调。　　细胞凋亡通路的受损被认为是结肠癌发生过程中的常见事件。为了阐明细胞凋亡在结肠组织肿瘤发生中的调控作用，检测了结肠组织细胞凋亡发生情况和凋亡相关蛋白质的表达变化。TUNEL分析结果表明LGP处理组发生大量细胞凋亡，而在正常组和模型组中观察不到TUNEL阳性细胞。WB和IHC分析观察到模型组结肠组织中抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xL的上调，而LGP处理后显著降低这两种抗凋亡蛋白质的表达。同时，在LGP处理组中观察到明显的Caspase-9和Caspase-3的激活，说明LGP通过启动内源型细胞凋亡通路引发细胞凋亡。另外，模型组结肠组织中细胞增殖因子Ki67的表达明显上调，而LGP处理组显著抑制Ki67的表达。以上研究结果表明AOM/DSS促进小鼠结肠组织的细胞增殖，并通过上调抗凋亡蛋白质的表达，提高受损细胞的抗凋亡能力，进而获得了肿瘤的两种标志性特征：细胞增殖周期的激活和细胞凋亡通路的受阻，而LGP的处理很好地逆转以上双重细胞变异。　　研究报道肠道菌群在CRC发展中发挥不可忽视的调节作用。为了评估肠道菌群是否参与了LGP在体内的抗肿瘤作用，我们分析了抗生素处理后AOM/DSS小鼠模型中肿瘤发生率和炎症因子的变化。我们观察到抗生素预处理明显减弱LGP的抗肿瘤作用。同时，抗生素的预处理明显减弱LGP对iNOS和COX2表达的抑制作用。这些结果提示，AOM/DSS模型中LGP发挥的抗肿瘤作用和抗炎症作用可能受到肠道菌群的调控作用。　　为了研究LGP是否改变AOM/DSS诱导的CAC小鼠的肠道菌群组成及其代谢产物，本研究进行了16S测序和代谢组学分析。微生物多样性和代谢组学关联分析结果显示:LGP处理显著下调了血清中Creatine的水平，Creatine含量与Roseburia呈高度负相关，与Turicibacter、Erysipelotrichaceae呈高度正相关;LGP显著上调血清中Azelaicacid的含量，与Roseburia、Bifidobacterium高度正相关，与Alistipes、Turicibacter负相关；LGP上调血清中L-asparticacid含量，与Bifidobacterium正相关，与Turicibacter高度负相关。　　此外，本研究探讨了LGP的主要活性成分-人参皂苷Rh4(G-Rh4)的抗炎症作用。结合网络药理学和分子、细胞生物学研究，阐明了G-Rh4的抗炎症作用靶点和作用机制。G-Rh4是三醇型稀有人参皂苷，具有良好的药理特性。然而，其药理作用机制，尤其是抗炎症作用和相关作用机制尚不明确。我们利用网络药理学分析筛选出58个G-Rh4的抗炎症作用靶点，根据拓扑分析发现TNF-α、IL-6、IL-1β和STAT3是G-RH4抗炎症的关键作用靶点。GO分析结果表明，G-Rh4的抗炎症作用靶基因主要与一氧化氮生物合成过程、IL-6产生、炎症反应、脂多糖介导的信号通路、细胞增殖的调节有关。KEGG路径富集分析显示共同靶点主要集中在NF-κB信号通路、JAK-STAT信号通路、TNF信号通路、PI3K-AKT信号通路。为了验证基于网络药理学分析预测的G-Rh4的潜在作用机制，我们利用脂多糖(LPS)刺激的RAW264.7巨噬细胞，进行了G-Rh4的抗炎症作用的研究。结果表明G-Rh4显著抑制LPS诱导的TNF-α、IL-6、IL-1β的表达，有效抑制促炎症关键转录因子NF-?B和STAT3的活性。　　综上所述，LGP有利的抗CAC活性可能来自于多种机制的结合，包括调节肠道菌群、调节炎症和刺激细胞凋亡。本研究将为人参的临床应用提供可靠的理论和实践依据，将为抗炎症性结肠癌药物和抗炎症单体药物的研发提供有效靶标和先导化合物。

结肠癌;人参皂苷;网络药理学;炎症应答;细胞凋亡;肠道菌群

吉林大学

博士

微生物学

金英花

2023

中文

R735.35

2023-08-29（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

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