组织蛋白酶L在PHEV感染过程中的作用研究
病毒复制包括病毒吸附、进入、基因组转录和复制、组装和释放等，这些过程对于病毒的生存和致病性至关重要，且多数病毒复制需要依赖宿主相关蛋白的参与。研究发现，包括SARS-CoV-2等多种β-冠状病毒属成员复制过程中，溶酶体组织蛋白酶L（CTSL）通过切割病毒受体结合蛋白（S），便于病毒的吸附和进入，之后通过裂解内体中的病毒粒子利于释放基因组，继而启动病毒的复制过程，此外，CTSL可能在病毒劫持溶酶体促进子代病毒释放过程中通过其水解活性降解病毒，表明CTSL对β-冠状病毒复制发挥复杂的调控作用。猪血凝性脑脊髓炎病毒（Porcinehemagglutinatingencephalomyelitisvirus,PHEV）是β-冠状病毒属中首个被发现可侵入猪中枢神经系统的病毒。该病毒存在不断流行变异的风险，对养猪业的危害不容忽视。前期研究发现，PHEV感染导致CTSL异常表达，然而CTSL与PHEV复制的相关性并不明确。 首先，为明确PHEV感染对CTSL表达及其在溶酶体上分布的影响，本研究以PHEV感染小鼠神经瘤母细胞（N2a细胞）为模型，通过WesternBlot和荧光定量PCR（RT-qPCR）检测发现，在病毒感染的0-24hours（hpi），未成熟型和成熟型CTSL在蛋白与mRNA水平上并未发生显著变化，但48hpi，未成熟型和成熟型CTSL在蛋白与mRNA水平上均表达异常；应用溶酶体相关膜蛋白（LAMP1）和CTSL抗体，通过间接免疫荧光检测发现，PHEV感染后CTSL与LAMP1共定位显著增强，表明PHEV感染导致CTSL表达及其在溶酶体上的分布增多。其次，为揭示CTSL在PHEV复制过程中的作用，本研究设计合成靶向CTSL的siRNAs；再者，将小鼠的CTSL基因序列成功克隆至pCMV-C-EGFP载体中，构建表达CTSL的重组质粒pCMV-C-EGFP-CTSL，分别将其转染N2a细胞，接种病毒，并在不同时间段收集mRNA样品，通过RT-qPCR检测，发现敲低CTSL可以抑制病毒的吸附与进入，但并未影响病毒增殖；过表达CTSL后可以促进病毒的吸附和进入，并抑制病毒增殖，表明CTSL在PHEV吸附和进入等复制过程中发挥复杂的调控作用。 此外，前期工作中，我们发现海藻糖具有显著抑制PHEV复制的作用，但具体机制并完全不清楚。为了揭示CTSL在海藻糖抑制PHEV复制过程中的作用，通过RT-qPCR方法，检测海藻糖处理前后病毒吸附和进入变化，发现海藻糖可显著抑制PHEV的吸附与进入。此外，通过WesternBlot和RT-qPCR检测发现，TRE处理下调N2a细胞中CTSL的表达。以PHEV感染敲低或过表达CTSL的N2a细胞为模型，通过检测海藻糖处理前后病毒吸附和进入变化，发现敲低CTSL并不影响海藻糖抑制PHEV的吸附与进入，而过表达CTSL能减弱海藻糖对病毒的吸附与进入的抑制作用，暗示海藻糖通过下调CTSL抑制PHEV的吸附和进入。再者，前期研究表明溶酶体蛋白PGRN在海藻糖抑制PHEV复制过程中发挥重要作用，为了初步探讨CTSL在PGRN介导海藻糖抑制PHEV复制过程中的作用，我们利用实验室已经构建好的PGRN敲除细胞系，同时接种病毒并加入海藻糖，通过RT-qPCR检测发现，在海藻糖抑制PHEV复制过程中PGRN缺失并不改变海藻糖对CTSL表达的影响，暗示PGRN和CTSL在海藻糖抑制PHEV复制过程中各自发挥调控作用。 总之，本研究发现PHEV感染导致CTSL表达及其在溶酶体上的分布异常，并且CTSL影响PHEV吸附和进入等复制过程。此外，结合CTSL表达异常与海藻糖抗PHEV效果的相关性研究，证实CTSL在海藻糖抑制PHEV吸附和进入等过程中发挥重要作用，表明CTSL与PHEV复制密切相关。这些结果将有助于揭示PHEV复制机制，同时为以CTSL为靶点开发潜在的抗PHEV药物提供参考。
猪血凝性脑脊髓炎病毒;感染过程;组织蛋白酶L;海藻糖;颗粒蛋白前体;溶酶体;病毒复制
吉林大学
硕士
基础兽医学
兰云刚
2023
中文
S852.651
2023-08-29（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）