柚皮素肺靶向微球增强多黏菌素对多重耐药肺炎克雷伯菌的抗菌活性及作用机制
携带超级耐药基因的革兰氏阴性菌已成为畜禽养殖和人类健康的重大威胁.多黏菌素对革兰氏阴性菌具有较强的杀菌效果,被用作重度细菌感染,特别是耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌感染的"最后一道防线".然而,质粒介导的多黏菌素耐药基因mcr-1(mobilecolistinresistance-1)极其相关耐药基因(mcr-3~mcr-10)在不同革兰氏阴性菌之间通过水平转移,不断传播、进化、变异,导致临床上常见的革兰氏阴性菌如肺炎克雷伯菌、大肠杆菌和沙门菌等对多黏菌素产生耐药性,临床一线抗生素对此类耐药菌株几乎全部失效.因此,临床上迫切需要研发针对MCR-1介导的超级耐药菌株的新型抗菌药物和抗菌治疗策略. 本课题组前期研究发现多种天然化合物可有效抑制MCR-1转移磷酸乙醇胺(Phosphoethanolamine,PEA)的生物学活性,进而恢复多黏菌素的体内外抗菌活性.但天然化合物因水溶性差,膜渗透性低,造成有效的血药浓度极低,进而影响了体内的治疗效果,严重制约了其作为多黏菌素抗菌增效剂在临床上的应用.本研究从天然化合物应用价值的角度出发,选择安全无毒,与多黏菌素具有显著体外协同效果的二氢黄酮类化合物柚皮素,进行靶向微球制剂的制备,以期通过递送技术,实现靶向治疗的目的.本研究建立肺炎克雷伯菌感染试验动物模型,进一步分析肺靶向柚皮素微球与多黏菌素体内协同抗感染作用,为治疗多重耐药肺炎克雷伯菌等革兰氏阴性菌感染提供具有临床应用价值的研究策略. 本研究通过棋盘法-最小抑菌浓度检测试验筛选获得了以柚皮素为代表的多黏菌素增效剂,将多黏菌素对耐药菌株如肺炎克雷伯菌、大肠杆菌和沙门菌等的最小抑菌浓度(MinimumInhibitoryConcentration,MIC)值降低至敏感(≤2μg/mL)浓度.通过生长曲线试验和时间-杀菌曲线试验等验证了柚皮素在无抑菌活性的浓度条件下(≤128μg/mL),可显著恢复多黏菌素对MCR-1阳性耐药菌的抗菌活性,且在连续诱导后细菌不产生耐药性(与多黏菌素相比,MIC值增高不显著).构效关系分析表明,在芳香环B环的4''位或芳香环A环的5、7位引入羟基后,柚皮素对多黏菌素的抗菌活性增强2~4倍,而C环2′,3′位引入双键,抗菌活性减弱4倍,黄烷酮母核是柚皮素增强多黏菌素抗菌活性的结构基础,C环开环后,协同抗菌活性降低8倍.根据柚皮素的结构特征及化学特性参数,本研究进一步通过甘草素、芹菜素和红花素等具有类似结构的黄酮类化合物进行了确证,均可不同程度增强多黏菌素抗菌活性. 为确证柚皮素协同多黏菌素的抗菌作用机制,本研究通过薄层层析色谱(TLC)和液相联用质谱(LC-MS)验证了柚皮素能够明显抑制MCR-1蛋白切割荧光底物NBD-甘油-3-PEA上的磷酸乙醇胺基团,干扰MCR-1蛋白的功能.通过荧光光谱检测发现柚皮素可通过静态淬灭的方式与MCR-1形成复合物,引发蛋白自体荧光强度降低.通过紫外光谱检测发现,柚皮素可影响MCR-1蛋白结构,使蛋白结构中具有紫外吸收强度的氨基酸残基如色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)等被暴露,紫外吸收强度明显增强.圆二色谱检测进一步证实,经32μg/mL柚皮素处理后,MCR-1蛋白的二级结构中β-转角、β-折叠和不规则卷曲均发生不同程度的变化.分子对接和分子动力学模拟结果表明,柚皮素可结合至MCR-1蛋白的活性中心从而抑制其活性,进一步氨基酸残基突变对分子动力学模拟的可靠性进行了验证.Thr283、Ser284及Gly476等氨基酸位点突变后,柚皮素与多黏菌素的协同效果显著降低(P＜0.01).此外,本研究通过转录组学分析发现,经32μg/mL柚皮素共培养处理后,肺炎克雷伯菌K.pneumoniaeZJ02的双组分调控系统(二元调控系统)中与LPS修饰和PEA转移相关的基因eptB、pmrB、arcA和phoR转录水平均不同程度下调.同时,柚皮素可显著上调K.pneumoniaeZJ02的TCA循环和氧化磷酸化相关基因的转录水平,激活ROS介导的杀菌过程.因此,柚皮素可通过多种途径显著恢复多黏菌素对耐药革兰氏阴性菌的体外抗菌活性. 由于柚皮素自身理化性质的影响,水溶性极差,体内有效的血药浓度极低,在抗耐药肺炎克雷伯菌感染的小鼠治疗实验中,柚皮素与多黏菌素协同抗菌效果十分不理想.因此,结合肺炎克雷伯菌的致病特征,本研究采用经FDA批准的药用辅料PLGA为载体,采用高压均质技术制备了柚皮素微球.体外协同实验结果表明,柚皮素微球联合多黏菌素具有明显的抗菌活性,无明显的细胞毒性.采用近红外荧光染料(IR783染料)经活体成像技术评估柚皮素微球在小鼠体内的分布、降解行为,成像结果表明所制备的柚皮素微球具有明显的肺部靶向性.HPLC测定结果表明,微球递送系统明显提高了柚皮素在肺组织中的累积浓度.在肺炎克雷伯菌感染的小鼠治疗实验中,与模型组相比,协同作用下感染小鼠的存活率提高至60%.同时,柚皮素微球与多黏菌素联合具有明显的抗炎作用,与模型组相比,联合治疗后小鼠肺泡灌洗液中中性粒细胞的数量降低了29.61%. 综上,本研究开发了一种具有肺靶向功能的柚皮素微球制剂,显著增强了多黏菌素在体内外的抗菌活性,提高了感染小鼠的存活率.为多黏菌素治疗多重耐药肺炎克雷伯菌感染提供了靶向性的抗菌增效剂,同时为解决天然化合物成药难题提供了新的研究思路.
柚皮素;肺靶向微球;多黏菌素;协同作用;多重耐药肺炎克雷伯菌;大肠杆菌
吉林大学
博士
基础兽医学
邓旭明
2023
中文
S852.61
2023-08-29（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）