鹿皮胶原肽的制备、体外抗氧化损伤和体内抗衰老作用及其机制研究
目的：胶原蛋白肽具有潜在的抗衰老作用，已被证实能够促进健康、延缓衰老并改善生活质量。通过筛选酶解鹿皮胶原蛋白（DC）的最佳工艺得到鹿皮胶原蛋白多肽（DCPs），并研究其抗衰老作用，为DCPs作为抗衰老全身性补充剂提供有力依据。 方法：DC经几种常见蛋白酶酶解后，测定各DCPs的得率，进行理化性质的研究（pH、NaCl对DCPs溶解性的影响，对DCPs吸油性、乳化性、乳化稳定性的研究），体外抗氧化活性研究（DPPH、ABTS、羟自由基清除实验），并对不同DCPs进行分子量测定，选取最佳酶解工艺。采用木瓜复合胰蛋白酶制备DCPs，对DCPs进行表征，包括DCPs的外观检查，SDS-PAGE法测定DCPs的分子量范围，分析DCPs的氨基酸组成。 采用CCK8法检测H2O2和DCPs对HepG2细胞的细胞毒性，采用结晶紫染色法观察H2O2对HepG2细胞形态的影响。采用CCK8法检测DCPs对HepG2细胞氧化损伤的保护作用，ROS荧光探针法检测DCPs对细胞内ROS生成的影响，流式细胞仪检测DCPs对HepG2细胞凋亡的影响，ELISA法检测细胞中抗氧化酶（SOD、GSH-Px、CAT）的活性及丙二醛（MDA）含量。 采用全自动生化分析仪对小鼠血液生化指标进行检测，采用ELISA法检测小鼠血清、肝脏和肾脏中SOD、GSH-Px、CAT的活性及MDA含量，采用HE染色法对小鼠肝脏、肾脏进行组织病理学检测。 RT-PCR法检测肝组织中Nrf2、SOD1、CAT和HO-1基因的表达水平。Westernblot实验检测小鼠肝组织中pAkt、Akt、HO-1和Nrf2蛋白的表达水平。 对胶原多肽口服液进行处方筛选，确定了口服液的最佳体积配比，包括DCPs溶液、风味调配物、脱苦物以及稳定剂的最佳添加量。 结果：使用木瓜复合胰蛋白酶酶解的DCPs肽得率最高，达42.67±2.97%，同时具有最优的理化性质、最强的体外抗氧化活性和最低的分子量，因此选用木瓜复合胰蛋白酶酶解的DCPs用于后续的研究。DCPs为白色粉末，外观质地疏松且均匀；测得DCPs的分子量小于14.4KDA；DCPs中含有18种氨基酸。 5.0-250μg/mL的DCPs对HepG2细胞无明显毒性作用；1.0-1.5mmol/L的H2O2处理细胞后，存活率随剂量升高而下降，当H2O2浓度为1.3mmol/L时，细胞存活率为56.77±5.98%；通过结晶紫染色法对细胞进行形态学分析，证实H2O2的毒性作用；DCPs（25.0-100.0μg/mL）可显著提高细胞活力、减少细胞内ROS积累、减轻细胞凋亡并上调细胞内SOD、GSH-Px、CAT的活性、降低MDA含量。 DCPs能显著改善D-半乳糖诱导衰老小鼠的血液生化指标，上调血清、肝脏和肾脏中SOD、GSH-Px、CAT的活性，降低MDA的含量并发挥对小鼠肝脏、肾脏的保护作用。 Realtime-PCR检测结果表明，给予DCPs可上调小鼠肝组织中Nrf2及其下游靶基因SOD1、CAT、和HO-1mRNA的表达。Westernblot结果显示，给予DCPs使小鼠肝组织中pAkt/Akt的比值和Nrf2转录因子及其下游靶蛋白HO-1的蛋白表达上升，表明DCPs可通过Akt信号激活Nrf2，减轻肝损伤。 通过正交实验优化参数，得到的口服液最佳配方是：DCPs溶液添加量20％，柠檬酸添加量0.8％，蔗糖添加量8%，蜂蜜添加量5％，黄原胶、CMC-Na、EDTA-2Na添加量均为0.1%、山梨酸钾添加量为0.1%。所制得的口服液颜色均一，口感鲜美。 结论：成功提取DCPs，具有较好的理化性质，较强的抗氧化活性，较低的分子量和丰富的氨基酸；对HepG2细胞的氧化损伤和小鼠衰老具有良好的保护作用；通过激活Akt/Nrf2/HO-1通路发挥抗衰老作用；成功制备胶原多肽口服液。
鹿皮胶原蛋白多肽;过氧化氢;氧化损伤;D-半乳糖;抗衰老作用
吉林大学
硕士
药学
裴瑾
2023
中文
R977.6
2023-08-29（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）