连接蛋白Cx43通过调节JNK/NF-κB信号通路在牙周组织氧化损伤中的作用研究
研究背景： 牙周炎是一种由牙周致病微生物和宿主固有免疫系统作用失调引起的慢性炎症性疾病。研究发现氧化应激微环境是牙周炎关键的致病机制之一，剧烈的氧化应激反应可通过产生的大量活性氧（reactiveoxygenspecies，ROS）从而对牙周组织造成不可逆性的损伤。然而，氧化应激在牙周炎致病机制中的确切作用尚不清楚。 连接蛋白43（connexin43，Cx43）介导的缝隙连接（gapjunctions，GJs）（Cx43-GJs）是维持机体内环境稳态的重要结构之一。然而，在病理状态下，Cx43-GJs允许ROS等应激信号在细胞间传递，因此它被认为是组织损伤恶化和放大的生物学基础。大量研究表明Cx43-GJs功能增加可能是以氧化应激为主要致病机制的疾病的共同特征。然而，Cx43-GJs在牙周炎中的作用仍然知之甚少。C-Jun氨基末端激酶(C-JunN-terminalkinase,JNK)/核因子-κB(nuclearfactorkappa-B,NF-κB)信号通路在多种细胞功能调节中发挥核心作用，当该信号通路被过度激活后可引发机体内环境紊乱。然而，Cx43-GJs与JNK/NF-κB信号通路的调节关系以及两者在牙周炎进展中的作用仍有待充分阐明。 研究目的： 本研究旨在探讨Cx43-GJs在牙周炎致病机制中的免疫调节作用，以及探究氧化应激、Cx43和JNK/NF-κB信号通路在牙周炎进展中的作用机制。 研究方法： 1.体外实验：常规分离并培养人牙周韧带细胞（humanperiodontalligamentcells，hPDLCs)，通过过氧化氢（hydrogenperoxide，H2O2）刺激hPDLCs构建体外牙周炎氧化应激微环境，并使用18-α-甘草次酸（18-α-glycyrrhizicacid，GA）（一种经典的缝隙连接药理抑制剂）和SP600125（JNK信号分子抑制剂）对细胞实验进行干预治疗。 （1）通过CCK-8试剂盒检测H2O2、GA和SP600125对hPDLCs细胞活力的影响。 （2）通过“降落伞”染料偶联试验评价hPDLCs内缝隙连接细胞间通讯能力。 （3）通过检测ROS含量、超氧化物歧化酶（superoxidedismutase，SOD）活性和丙二醛（malondialdehyde，MDA）水平评价胞内氧化应激水平。 （4）通过Westernblot和qRT-PCR法检测hPDLCs内Cx43、P-JNK、NF-κB、凋亡相关因子以及促炎细胞因子的表达水平。 2.体内实验：将24只雄性Wister大鼠按照随机数字表法分为三组：对照组、牙周炎组、牙周炎+GA干预组（给药方式及剂量：灌胃给药，30mg/kg/day），每组8只。采用结扎法在牙周炎组和牙周炎+GA组大鼠的双侧上颌第一磨牙构建牙周炎模型。2周后将大鼠进行安乐死并检查以下指标： （1）通过检测大鼠牙周临床指标、Micro-CT分析以及牙周组织Hamp;E和TRAP染色来评价牙周炎的病变程度。 （2）通过Westernblot、免疫组织化学法（immunohistochemistry，IHC）和PCR法检测各组大鼠牙周组织中Cx43/JNK/NF-κB信号通路的表达水平。 （3）通过检测牙周组织中线粒体形态、线粒体膜电位、ROS含量、8-OHdG和SOD1表达水平以及血清中SOD活性和MDA含量来评价牙周组织中氧化应激水平。 （4）通过TUNEL染色和检测凋亡相关因子的表达水平来评价牙周组织中凋亡水平。 研究结果： 1.Cx43对胞内氧化应激和炎症反应的调节作用： 与对照组相比，hPDLCs经H2O2处理后细胞活力显著降低，胞内Cx43的表达水平、细胞间通讯能力、ROS含量和MDA水平以及促炎细胞因子表达水平明显升高，抗氧化物酶SOD活性下降；当hPDLCs经GA预处理抑制Cx43的表达和功能后，上述指标均发生逆转。 2.JNK/NF-κB信号通路对胞内氧化还原状态和凋亡的调节作用以及与Cx43之间的作用关系： 当hPDLCs经H2O2处理后，胞内JNK磷酸化水平和NF-κB蛋白表达水平升高。而细胞经SP600125预处理后，与H2O2组相比，H2O2+SP600125组细胞活力有所恢复且胞内ROS含量降低。此外，当细胞经GA或SP600125预处理后，胞内Cx43、P-JNK、NF-κB和凋亡相关因子表达水平较H2O2组均降低。 3．大鼠牙周炎相关指标的检测： （1）牙周临床指标检测结果： 对照组大鼠未探及牙周袋，探诊未见明显出血，牙齿无松动；牙周炎组大鼠可探及深牙周袋，探诊出血明显，牙齿出现不同程度的松动；牙周炎+GA组大鼠牙周袋变浅，牙龈探诊出血程度及松动度均减轻。 （2）Micro-CT扫描结果： 与对照组相比，牙周炎组大鼠上颌第一磨牙区骨质相关参数，包括骨密度(bonemineraldensity,BMD)、相对骨体积(bonevolume/totalvolume,BV/TV)和骨小梁厚度(trabecularthickness,Tb.Th)均下降，根分叉区骨质吸收明显且釉牙骨质界(cement-enameljunction，CEJ)到牙槽嵴顶(alveolarbonecrest，ABC)的距离显著增加；而经18-α-甘草次酸药物干预后，上述指标均发生逆转。 （3）Hamp;E和TRAP染色结果： 与对照组相比，牙周炎组大鼠上颌第一磨牙上皮完整性破坏、附着丧失严重、牙龈组织中上皮钉突显著伸长且固有层中伴有大量的炎症细胞浸润，牙槽骨表面活化的破骨细胞数目增多；然而，经18-α-甘草次酸干预后上述病理表现有所改善。 4．Cx43/JNK/NF-κB信号通路在牙周炎进展中的调节作用： 与对照组相比，牙周炎组大鼠牙周组织中Cx43、P-JNK和NF-κB表达水平显著升高；经18-α-甘草次酸药物干预后，三者表达水平均下降。 5．Cx43/JNK/NF-κB信号通路对牙周组织内氧化应激和凋亡水平的影响： 与对照组组相比，牙周炎组大鼠牙周组织中线粒体表现出明显的肿胀和空泡化，线粒体膜电位降低，ROS含量、8-OHdG、Bax和Caspase3表达水平以及TUNEL阳性细胞数量较对照组大鼠显著升高，SOD1和抗凋亡蛋白Bcl-2表达水平下降；而经18-α-甘草次酸药物干预后，上述指标均发生逆转。 研究结论： 1．抑制Cx43的表达和功能可有效减轻H2O2诱导的hPDLCs氧化损伤。 2．JNK/NF-κB信号通路可能与Cx43相互作用，共同调节hPDLCs的氧化还原状态和凋亡。 3．18-α-甘草次酸可有效减轻大鼠牙周炎。 4．抑制Cx43/JNK/NF-κB信号通路可以减轻牙周组织内氧化应激水平和凋亡水平。 5．Cx43/JNK/NF-κB信号通路在促进牙周炎进展中发挥重要作用，而抑制该信号通路可有效缓解牙周炎。
牙周炎;连接蛋白Cx43;信号通路;牙周组织;氧化损伤
吉林大学
硕士
口腔临床医学
于维先
2023
中文
R781.42
2023-08-29（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）