PBX1在H2O2诱导HaCaT细胞损伤中的保护作用及机制研究
前言： 皮肤作为人体最大的体表器官，构成人体与环境相互作用的第一道屏障，不断抵抗外界环境刺激。随着空气污染加剧，皮肤更容易受坏境中的有害物质损害。活性氧（reactiveoxygenspecies，ROS）是皮肤细胞受损的常见产物，过量的ROS导致机体细胞DNA、蛋白质和脂质氧化损伤。因此，降低细胞内过量的ROS对于减少因氧化应激而造成的细胞损伤具有重要意义。前B细胞白血病转录因子1（pre-B-cellleukemiahomeobox1,PBX1）是同源盒基因家族一员，具有促进细胞增殖等能力。TAT是一组具有高效穿透组织屏障能力的短肽，将其与PBX1相连构成融合蛋白TAT-PBX1，促进PBX1进入细胞发挥生物学作用。本课题拟用H2O2作为ROS诱导剂，采用慢病毒转导建立过表达PBX1的HaCaT细胞系，利用大肠杆菌原核表达系统大量制备融合蛋白TAT-PBX1，探讨PBX1在H2O2诱导HaCaT细胞损伤中的保护作用及其机制。 目的： 研究H2O2对HaCaT细胞的损伤作用；研究PBX1对HaCaT细胞的生物学影响；探讨PBX1在H2O2诱导HaCaT细胞损伤中的保护作用及其机制；探讨融合蛋白TAT-PBX1在H2O2诱导HaCaT细胞损伤中的保护作用及其机制。 方法： 1．H2O2处理HaCaT细胞，活细胞成像系统观察细胞形态学改变；CCK8法检测细胞存活率；流式细胞术检测细胞凋亡情况；活细胞成像系统检测H2O2不同时间点以及不同浓度H2O2相同时间点细胞内ROS水平。 2．建立过表达PBX1的HaCaT细胞系，活细胞成像系统和Westernblot法检测HaCaT细胞PBX1表达情况；生长曲线检测PBX1对HaCaT细胞增殖的影响；平板克隆实验检测PBX1对HaCaT细胞克隆形成能力的影响；细胞划痕实验检测PBX1对HaCaT细胞迁移的影响；Westernblot实验检测PBX1对HaCaT细胞DNA损伤及修复和凋亡相关蛋白表达的影响。 3．给予各组一定剂量H2O2后，活细胞成像系统观察细胞形态学改变；CCK8法检测细胞存活率；流式细胞术检测细胞内ROS水平；流式细胞术检测细胞凋亡情况；Westernblot实验检测DNA损伤及修复和凋亡相关蛋白表达水平。 4．利用原核表达系统制备TAT-PBX1蛋白，镍柱亲和层析提纯样品；脉冲稀释复性；浓缩冻干制成粉剂；Westernblot实验检测标签及目的蛋白；Westernblot和免疫荧光检测TAT-PBX1穿膜效果；CCK8法检测不同浓度TAT-PBX1对HaCaT细胞存活率的影响；流式细胞术检测细胞内ROS水平；流式细胞术检测细胞凋亡情况；Westernblot实验检测DNA损伤及修复和凋亡相关蛋白表达水平。 研究结果： 1.H2O2诱导HaCaT细胞损伤 （1）H2O2诱导HaCaT细胞形态学改变：镜下观察结果表明，随着H2O2浓度的增加，细胞边缘逐渐模糊，透光性逐渐降低，最后脱落碎片化。 （2）H2O2降低HaCaT细胞存活率：CCK8实验结果表明，随着H2O2浓度的增加，HaCaT细胞存活率逐渐下降。 （3）H2O2促进HaCaT细胞凋亡：流式细胞术结果表明，随着H2O2浓度的增加，HaCaT细胞凋亡率逐渐上升。 （4）H2O2升高HaCaT细胞内ROS水平：荧光拍照结果表明，1.5mmol/LH2O2处理不同时间，荧光强度呈先增加后降低趋势，并在4h附近达到峰值；不同浓度H2O2处理HaCaT细胞4h，荧光强度呈先增加后降低趋势，并在1.5mmol/L浓度附近达到峰值。 2.PBX1对HaCaT细胞生物学影响 （1）建立过表达PBX1的HaCaT细胞系：活细胞成像系统和Westernblot实验结果表明，成功建立过表达PBX1及其空载体的HaCaT细胞—pLVX-PBX1及pLVX-Ctrl。 （2）PBX1促进HaCaT细胞增殖：生长曲线结果表明，从第4天开始pLVX-PBX1组细胞数显著增多。 （3）PBX1促进HaCaT细胞克隆形成：平板克隆实验结果表明，pLVX-PBX1组细胞克隆数显著增多。 （4）PBX1促进HaCaT细胞迁移：细胞划痕实验结果表明，划痕24h后pLVX-PBX1组细胞迁移率显著增高。 （5）PBX1下调HaCaT细胞DNA损伤以及修复相关蛋白表达：Westernblot实验结果表明，pLVX-PBX1组KU80、KU70、Rad51、γH2AX蛋白表达水平显著下降。 （6）PBX1下调HaCaT细胞凋亡相关蛋白表达：Westernblot实验结果表明，pLVX-PBX1组PARP-1、PAR、AIF、CytC、CleavedCaspase-3蛋白表达水平显著下降。 3.PBX1在H2O2诱导HaCaT细胞损伤中的保护作用 （1）PBX1增加H2O2损伤后HaCaT细胞存活率：CCK8实验结果表明，PBX1增加H2O2处理后细胞存活率。 （2）PBX1降低H2O2引起的HaCaT细胞内ROS水平：流式细胞术结果表明，PBX1降低H2O2处理后细胞ROS水平。 （3）PBX1减少H2O2引起的HaCaT细胞凋亡：流式细胞术结果表明，PBX1降低H2O2处理后细胞凋亡率。 （4）PBX1下调H2O2引起的HaCaT细胞DNA损伤及修复相关蛋白表达：Westernblot结果表明，PBX1下调H2O2处理后细胞KU80、KU70、Rad51、γH2AX表达。 （5）PBX1下调H2O2引起的HaCaT细胞凋亡相关蛋白表达：Westernblot结果表明,PBX1下调H2O2处理后细胞PARP-1、PAR、AIF、CytC、CleavedCaspase-3表达。 4.融合蛋白TAT-PBX1的制备及其在H2O2诱导HaCaT细胞损伤中的保护作用 （1）成功筛选出高表达目的蛋白菌株：选取7个单克隆表达菌株，Westernblot检测HA、His、PBX1，Clone6菌株表达量较高。 （2）成功获取并鉴定融合蛋白TAT-PBX1：SDS-PAGE检测结果表明，洗脱液含有较纯的目的蛋白。Westernblot鉴定蛋白HA、His、PBX1。 （3）融合蛋白TAT-PBX1穿膜进入HaCaT细胞：活细胞成像系统结果表明，TAT-PBX1组HA绿色荧光较强。Westernblot实验结果表明，TAT-PBX1处理组上调HA、His、PBX1表达水平。 （4）TAT-PBX1增加H2O2损伤后HaCaT细胞存活率：CCK8法检测结果表明，TAT-PBX1增加H2O2处理后细胞存活率。 （5）TAT-PBX1降低H2O2诱导的HaCaT细胞内ROS水平：流式细胞术结果表明，TAT-PBX1降低H2O2处理后细胞ROS水平。 （6）TAT-PBX1降低H2O2诱导的HaCaT细胞凋亡率：流式细胞术结果表明，TAT-PBX1降低H2O2处理后细胞凋亡率。 （7）TAT-PBX1下调H2O2引起的HaCaT细胞DNA损伤及修复相关蛋白表达：Westernblot结果表明，TAT-PBX1下调H2O2处理后HaCaT细胞KU80、KU70、Rad51、γH2AX表达。 （8）TAT-PBX1下调H2O2引起的HaCaT细胞凋亡相关蛋白表达：Westernblot结果表明，TAT-PBX1下调H2O2处理后HaCaT细胞PARP-1、PAR、AIF、CytC、CleavedCaspase-3表达。 结论： 1.H2O2促进HaCaT细胞产生ROS和凋亡。 2.PBX1促进HaCaT细胞增殖。 3.PBX1可降低ROS水平、DNA损伤来降低H2O2对HaCaT细胞损伤。 4.TAT-PBX1可降低ROS水平、DNA损伤来降低H2O2对HaCaT细胞损伤。
H2O2;活性氧;PBX1;DNA损伤;细胞凋亡
吉林大学
硕士
卫生毒理学
刘晋宇
2023
中文
R114
2023-08-29（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）