运动调控乳酸/mTOR/TFEB改善自噬溶酶体功能抗阿尔茨海默病的机制研究
阿尔茨海默病（Alzheimer''sdisease,AD）是一类典型的年龄相关性神经退行性疾病。AD患者临床表现出严重的记忆丧失和认知功能障碍，并伴有情绪异常。AD的发病机制十分复杂，受多种遗传和环境因素影响，迄今尚未阐明。研究发现，AD患者大脑中海马体和内嗅皮层区域出现β-淀粉样蛋白(amyloid-β，Aβ)沉积和Tau过度磷酸化，并伴随神经元大量丢失。 除上述两种AD典型的病理特征（Aβ和Tau）之外，自噬流受损也是AD已知病理特征的重要组成部分。自噬作为细胞内蛋白质质量控制机制之一，可降解细胞中因错误折叠而聚集的蛋白质和异常细胞器。在患者出现AD临床表现之前，脑内便出现自噬功能受损。自噬在AD进程中具有双重作用，自噬功能正常时，在大脑内发挥清除错误折叠蛋白的作用。在AD患者的大脑中观察到未成熟的自噬体积累，提示自噬体-溶酶体降解过程受损。自噬异常具体表现为神经元中大量的自噬囊泡堆积，Aβ等错误折叠蛋白被包裹在其中无法降解，自噬通量受阻。细胞自噬受到转录因子EB的严密调控，TFEB调控自噬-溶酶体通路相关的基因表达并促进溶酶体生物发生，其活性可通过mTOR信号通路调控。 越来越多的研究证据表明，运动对大脑功能产生积极影响，可降低包括AD在内的神经退行性疾病的风险，改善认知功能，缓解患者的神经精神症状。与AD药物治疗相比，运动干预具有副作用少，无显著经济成本，患者依从性好等特点。然而运动对脑内自噬的影响，以及是否通过自噬改善AD小鼠认知功能目前尚未清楚。 乳酸是机体运动后产生的代谢产物之一，已被证实具有促进神经发生的作用。此外，近年来的研究表明，外源性给予乳酸可模拟运动过程的乳酸变化。然而关于运动是否可以调控乳酸调节mTOR/TFEB信号通路，激活AD小鼠的自噬溶酶体功能，对抗AD神经元细胞氧化应激损伤仍有待验证。 本课题旨在动物和细胞水平上探讨运动调控乳酸/mTOR/TFEB通路调控阿尔茨海默病神经认知功能损伤的干预作用机制，并深入探索运动模拟物乳酸激活神经元细胞自噬溶酶体功能的分子机制。 实验研究内容如下： 1.运动保护D-gal联合AlCl3诱导的认知功能障碍小鼠的神经元损伤 方法：在动物水平上，采用D-gal联合AlCl3构建AD小鼠模型。造模完成后将模型小鼠分组为乳酸给药组和运动训练组，8周后，通过Morris水迷宫实验观测对照组、AD模型组、乳酸给药组和运动训练组小鼠的学习记忆能力。对各组小鼠的脑组织切片进行HE染色和Nissl染色检测。TUNEL染色检测小鼠脑组织切片的神经元凋亡水平。通过乳酸检测试剂盒检测小鼠正常情况下、运动干预后和乳酸给药组织内的乳酸含量变化情况。在细胞水平上采用过氧化氢诱导N2a神经元细胞氧化应激损伤模型，采用MTT法检测细胞活力，验证乳酸对神经元细胞的保护作用。 结果：在AD模型组小鼠中出现明显的学习记忆能力受损，而乳酸给药和运动干预调节后出现明显的改善；AD模型组小鼠出现神经元丢失，而乳酸给药和运动干预改变AD模型小鼠的神经元丢失情况；AD模型组小鼠细胞凋亡数量增加，而乳酸给药和运动干预后细胞凋亡数量明显减少；与空白对照组相比，乳酸给药和运动干预后血清、骨骼肌和脑组织中乳酸含量显著升高。表明在运动干预后AD模型小鼠的认知功能障碍得到明显的改善，乳酸组认知功能显著改善，与运动组无明显差异，提示外源性乳酸干预能够模拟运动训练对AD小鼠认知的改善作用，乳酸具有成为治疗AD药物的潜力。乳酸钠升高N2a细胞存活率，呈剂量依赖性，能够保护过氧化氢对N2a细胞的杀伤作用。 2.运动干预对模型小鼠神经元自噬溶酶体功能的影响 方法：本部分实验在动物水平上，采用免疫蛋白印迹法检测各组小鼠脑组织自噬相关蛋白（LC3Ⅰ/Ⅱ，SQSTM1/P62），溶酶体相关蛋白（CathepsinB）的表达。在细胞水平上，在过氧化氢诱导N2a细胞氧化应激损伤模型中，采用MDC荧光染色检测自噬体变化。 结果：运动干预和乳酸给药后小鼠脑组织中LC3Ⅱ/Ⅰ的比值增加，组织蛋白酶B的蛋白表达增加，结果提示运动干预和运动模拟物乳酸逆转了AD模型小鼠自噬溶酶体功能受损的情况。与模型组相比，乳酸钠给药后绿色荧光颗粒增加，提示自噬体数量增加；通过LysotrackerRed染色检测溶酶体数量，乳酸钠给药后增加了溶酶体的数量和荧光强度，表明乳酸给药会增强自噬溶酶体功能。 3.运动调控乳酸/mTOR/TFEB信号通路改善自噬溶酶体功能 方法：在动物水平上，进行免疫荧光染色检测各组小鼠脑组织切片中TFEB核易位情况。通过免疫蛋白印迹法检测通路相关蛋白p-mTOR/mTOR，p-TFEB/TFEB的表达情况。 结论：与模型组相比，运动干预和乳酸给药组小鼠皮层区域出现明显的TFEB入核。与模型组相比，运动干预和乳酸给药组小鼠中p-mTOR/mTOR，p-TFEB/TFEB下降，表明运动通过抑制mTOR进而促进TFEB核易位发挥作用。 综上所述，本课题研究采用过氧化氢诱导的神经元细胞N2a构建氧化应激模型，D-gal联合AlCl3的AD小鼠模型，证明了运动通过乳酸增强神经元自噬溶酶体功能，在改善AD小鼠病理症状起重要作用。明确运动可以调控乳酸/mTOR/TFEB信号通路增强自噬溶酶体功能，促进自噬流通畅，从而减轻AD小鼠认知功能障碍。
阿尔兹海默病;自噬溶酶体;乳酸;神经元细胞
吉林大学
硕士
药理学
张明
2023
中文
R749.16
2023-08-29（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）