小檗碱通过FOXO3a/BIM信号通路对阿尔兹海默症的改善作用及机制研究
研究背景：阿尔茨海默症（Alzheimer''sdisease，AD）是一种起病隐匿且进行性发展的慢性神经系统退行性疾病，以记忆障碍、语言功能和其他认知能力衰退为主要症状，可导致患者日常生活能力下降，出现精神行为异常，给家庭和社会带来极大的负担。全球AD患者人数已高达5000万，预计2050年将增加至15200万。AD已成为全球第五大死因，因此，寻找改善AD的药物，是目前科研人员亟待解决的主要问题。 FOXO家族与AD的发生有着密切的关系。β淀粉样蛋白（Aβ）斑块刺激可以导致FOXO3a的一系列翻译后修饰和核移位，并通过提高BIM表达来诱导神经元的氧化应激和细胞凋亡，最终导致神经元的丢失并引起一系列的神经退行性疾病。因此，FOXO3a/BIM可能是治疗阿尔茨海默症的一个潜在的位点。 小檗碱（分子式为C20H19NO5，分子量为353.36g/mol）是各种小檗属植物茎和根的主要异喹啉生物碱成分。小檗碱在传统的阿育吠陀和中药系统中有广泛的应用。它具有良好的药理活性，包括镇痛、抗炎、抗癌、降糖、抗高脂血症、心脏保护、增强记忆、抗抑郁、抗氧化、抗伤害、抗菌、抗HIV和降胆固醇作用。在课题组前期研究中，我们发现小檗碱不仅可以增强海马神经元的抗凋亡能力，同时也对糖尿病脑病的认知功能障碍具有改善作用。近年来研究也证明了小檗碱作为神经保护剂的显著效果。但小檗碱对阿尔茨海默症的治疗作用及其作用尚需要进一步明确。 研究目的：通过体内外实验研究小檗碱是否能通过FOXO3a/BIM通路改善阿尔兹海默症中的认知功能障碍和神经元损伤，以及探讨其相关机制。 方法与结果： 1.体内外水平明确小檗碱对AD认知功能障碍和神经元损伤的治疗作用 利用D-gal与AlCl3构建的AD小鼠模型，通过莫里斯水迷宫检测小鼠认知功能改善情况。处死并提取小鼠脑组织，进行HE、尼氏及TUNEL染色观察小鼠脑内神经元变性及凋亡情况。结果表明，小檗碱可以明显降低小鼠的逃逸潜伏期，改善小鼠的认知功能障碍，并减轻AD小鼠脑内的神经元凋亡和变性。随后，又利用HT22神经元细胞与Aβ25-35构建体外AD细胞模型，进行MTT细胞活力检测筛选Aβ25-35造模浓度和小檗碱给药的安全剂量及有效剂量。结果发现，40μM浓度的Aβ25-35可以使HT22细胞活力下降至70%左右，符合造模要求。在1μM浓度以下的小檗碱对HT22细胞没有明显杀伤效果。小檗碱在安全剂量范围内可以以剂量依赖性的方式提高HT22细胞的细胞活力，且0.2μM浓度的小檗碱改善作用最好，因此在后续实验中选择了40μM浓度的Aβ25-35进行造模和0.2μM浓度的小檗碱给药。 2.小檗碱通过FOXO3a/BIM信号通路治疗AD 通过网络药理学筛选获得小檗碱与AD具有潜在的结合位点共92个，随后通过蛋白-蛋白互作分析，KEGG通路富集与GO功能富集筛选与AD最相关的前20个靶点，其中，我们发现FOXO3a与PI3K/AKT通路在小檗碱和AD交联时具有较高的相关性。而在进一步的文献阅读中，FOXO3a与神经元细胞的凋亡有着密不可分的关系。 为了验证FOXO3a/BIM通路是否参与了小檗碱治疗AD的过程，首先，我们提取了小鼠动物模型的脑组织蛋白并利用WB技术检测了FOXO3a/BIM蛋白表达情况的改变。结果发现在模型组中FOXO3a磷酸化水平降低，BIM表达增高；小檗碱组中FOXO3a磷酸化水平升高，BIM表达降低。证明小檗碱可以在体内水平增加AD动物模型中FOXO3a的磷酸化水平并降低BIM蛋白表达。 随后，我们又提取HT22细胞AD模型的细胞蛋白进行了WB实验。与体内实验结果类似，在细胞蛋白WB实验中，Aβ25-35刺激后，细胞模型中的FOXO3a的磷酸化水平被显著抑制，而BIM的表达显著提高。小檗碱给药则增加了FOXO3a的磷酸化水平并降低了BIM的表达。FOXO3a在磷酸化水平下降后会导致其核易位程度增加。随后，为了观察小檗碱对FOXO3a核易位程度的影响，我们继续使用AD细胞模型进行免疫荧光实验，结果表明在Aβ25-35刺激下，FOXO3a的核定位水平增加，小檗碱则降低了核易位程度。通过体内外实验我们发现，FOXO3a/BIM通路可能是AD治疗的一个有效靶点。 3.小檗碱可以通过影响PI3K/AKT通路来调控FOXO3a/BIM信号通路 PI3K/AKT通路是FOXO3a/BIM通路的直接上游，PI3K的去磷酸化会导致AKT和FOXO3a的去磷酸化。因此，我们在体外水平使用PI3K抑制剂LY294002和或小檗碱给药并提取蛋白进行WB实验。随后检测了p-AKT/AKT、p-FOXO3a/FOXO3a、BIM的表达水平改变。结果表明，在模型组中，与对照组相比，p-AKT/AKT和p-FOXO3a/FOXO3a水平显著降低，BIM蛋白的表达显著升高。在小檗碱给药组中，p-AKT/AKT和p-FOXO3a/FOXO3a水平的下降被显著逆转，BIM表达水平明显降低。但在抑制剂组中，p-AKT/AKT和p-FOXO3a/FOXO3a水平被再次下调，BIM蛋白的表达也明显升高，小檗碱的治疗效果被LY294002消除，证明小檗碱可能通过影响PI3K/AKT通路来调控FOXO3a/BIM信号通路。 结论：小檗碱可以通过FOXO3a/BIM信号通路治疗阿尔兹海默症中的认知功能障碍和神经元损伤。
阿尔茨海默症;小檗碱;神经元;细胞凋亡;FOXO3a信号通路;BIM信号通路
吉林大学
硕士
药理学
陈立
2023
中文
R749.16
2023-08-29（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）