HIV-1进化阶段性包膜蛋白三聚体序贯免疫诱导广谱中和抗体的研究
人类免疫缺陷病毒（Humanimmunodeficiencyvirus,HIV）自发现以来，严重威胁全球人类健康，一直是科学研究的热点问题。由HIV感染引发的获得性免疫缺陷综合征（Acquiredimmunodeficiencysyndrome,AIDS），即艾滋病，是一种在全世界范围内流行的高危疾病。2022年联合国艾滋病规划署发布的报告显示，全球共有约3800万人感染艾滋病，其中约170万是14岁以下的儿童。虽然联合抗逆转录病毒疗法（Combinationantiretroviraltherapy,cART）能够将艾滋病变成一种可控制的慢性疾病，但研究人员始终相信，疫苗是彻底控制这种病毒的唯一手段。然而，目前尚无有效的HIV疫苗问世。因此，开发一种能诱导广谱中和抗体（Broadlyneutralizingantibodies,bnAbs）的HIV疫苗刻不容缓。 为应对高度突变的HIV病毒，通过疫苗诱导bnAbs，免疫原的设计和选择尤为重要。（1）诱导bnAbs的免疫原研究策略包括：靶向抗体生殖系的免疫原、激活抗体谱系前体B细胞的免疫原、使用最小抗原表位的免疫原等；（2）诱导bnAbs的免疫原序列设计思路包括：使用特定地理分离株、构建与当前流行株最为近似的共性基因序列（Consensussequence,Con）；（3）诱导bnAbs的免疫原结构生物学研究思路包括：可采用结构更稳定的、与天然结构更相似的Env三聚体免疫原，更容易诱导bnAbs产生。 通过对HIV与B细胞共进化过程的分析发现，在约80%异性性传播HIV感染者中，初次感染是由一种或两种奠基病毒（Transmitted/foundervirus,Vir-T/F）引发的。感染后，奠基病毒大量复制，产生逃逸突变，从而不断进化。由于患者体内病毒的进化领先于bnAbs的进化，所以bnAbs的产生可能是由于病毒多样性进化驱动的。因此，通过疫苗的方式刺激bnAbs谱系前体B细胞成熟，模拟临床患者体内病毒变异过程，重塑bnAbs成熟过程，可能是一种有效诱导bnAbs的疫苗策略。 前期研究中，我们发现了一位HIV临床患者CH505，并追踪了该患者临床血浆样品中的病毒与B细胞共进化过程。在其体内分离出靶向CD4结合位点（CD4bindingsite,CD4bs）的bnAbCH103和bnAbCH235。这两株bnAbs表现出较高的中和能力，分别可以中和55%和90%的HIV分离株。 基于此，本研究的目的是探究能否通过疫苗接种手段，在豚鼠中诱导广谱血清抗体产生。研究采用序贯免疫进化阶段性共有Env三聚体蛋白的方式，在豚鼠中模拟临床患者CH505中HIV病毒进化过程，激活bnAbs谱系前体B细胞，以重塑bnAbs成熟过程。 本研究首先分析了临床患者CH505感染后第4-160周的病毒Env序列库，构建了14条不同时间点的病毒Env共性基因序列，绘制了Env共性基因序列进化树。依据临床患者体内bnAbs成熟过程的分析结果，推断出可能驱动该过程的进化阶段性关键病毒。优化关键病毒Env共性基因序列，以获得稳定的三聚体Env免疫原，用于序贯免疫。本研究采用优化病毒自身结构（Uncleavedprefusion-optimized,UFO）和应用三聚基序（Trimermotif,MTQ）两种方式优化共性基因序列。瞬时转染HEK293-6E细胞系表达蛋白，纯化获取一系列三聚体免疫原序贯免疫豚鼠，分析豚鼠血清抗体的中和广谱度、中和效力、中和宽度及靶向性。 本研究的主要结果包括： 首先，本研究分析并获得了临床患者CH505感染后第4-160周血浆各时间点病毒库Env的共性基因序列，构建了Env共性基因序列进化树。发现在感染初期，病毒Env突变程度较低，随着bnAbs不断成熟，病毒在抗体的选择压力下不断突变，其突变位置集中在Env的V1、V4、V5和LoopD区域。根据突变结果推断出在bnAbs成熟过程中可能驱动抗体成熟的几个进化阶段性关键病毒，分别为Vir-T/F、Vir-w22、Vir-w30、Vir-w53和Vir-w78。此外，在CH505感染后第4周血浆中还发现了一个Env区单一氨基酸突变的自然突变体病毒Vir-w4.26（A501V），该病毒对bnAbCH103和bnAbCH235的敏感性比T/F病毒（Vir-T/F）高近10倍。对上述进化阶段性病毒的共性基因序列和Vir-w4.26的独有序列进行了基于UFO结构的优化。本研究还选择了CladeC奠基病毒BG505序列进行UFO优化，作为单一免疫对照组。 其次，进行了基于上述优化后序列的真核表达质粒构建和蛋白表达工作，使用Lectin亲和层析和Superdex200分子筛层析两步纯化方式，成功获取纯化的三聚体蛋白，并应用多种方式表征了上述蛋白的理化性质。发现免疫原能够正确形成三聚体，且抗原表位暴露情况良好。 最后，本研究以上述三聚体蛋白为免疫原序贯免疫豚鼠。初免蛋白分别为感染后第4周的共性基因序列三聚体蛋白T/F（T/F组）和独有序列三聚体蛋白w4.26（w4.26组），加强免疫分别免疫进化阶段性关键突变时间点的病毒共性基因序列三聚体蛋白w22，w30，w53和w78。 对豚鼠血清广谱性分析表明：（1）序贯免疫组与BG505单一免疫组相比，序贯免疫组的豚鼠血清显示出更广谱的中和活性。T/F组和w4.26组豚鼠血清广谱度比BG505单一免疫组血清分别高31.3%和26.7%；（2）序贯免疫过程中使用w4.26作为初免蛋白，其诱导的血清抗体中和广谱度和效力与T/F组有一定差异，w4.26组血清能够中和8种假病毒，而T/F组仅能中和7种。两组对假病毒的中和效力也有所差异。 对序贯免疫组血清特异性分析表明：本研究设计的序贯免疫组诱导的豚鼠血清特异性靶向假病毒CH119和假病毒398F1的多个表位，包括gp120/gp41interface、CD4bs和V2等。 对序贯免疫血清纵向中和宽度分析的结果表明：随序贯免疫加强次数增多，序贯免疫组血清的中和广谱度和效力都显著提升。第三次序贯加强后，序贯免疫组豚鼠血清仅能中和3种假病毒，而第五次序贯加强后，序贯免疫组豚鼠血清能中和超过7种假病毒。序贯免疫组血清纵向中和宽度显著优于BG505单一免疫原免疫。 另外，本研究还应用三聚基序MTQ替换了上述Env的gp41区，采用与前文所述相同的方式，构建了更稳定的三聚体免疫原序贯免疫豚鼠，并初步评价了豚鼠血清的广谱性。发现基于MTQ优化策略的蛋白序贯免疫也能诱导豚鼠广谱血清抗体的产生，序贯免疫组豚鼠血清的中和效力显著高于BG505单独免疫组。 本研究：（1）第一次采用序贯免疫结合共性基因序列的免疫方式，模拟临床患者自然感染过程中病毒进化过程，在豚鼠中诱导了广谱的血清中和活性；（2）对比BG505单一免疫组，本研究设计的基于模拟病毒变异过程的序贯免疫方式诱导的中和抗体强度和广谱度均显著提高；（3）采用了T/F蛋白和w4.26蛋白分别用于序贯免疫，发现T/F蛋白诱导血清的中和效力更强，w4.26蛋白诱导的血清广谱性更强；（4）使用了不同的三聚体稳定策略，成功表达了Env三聚体免疫原。发现使用UFO优化或MTQ基序的序贯免疫原都可以诱导豚鼠产生广谱的血清中和活性。 综上所述，本研究设计的序贯免疫进化阶段性共有三聚体免疫原，可以在豚鼠中诱导广谱血清中和活性。相较于BG505单一免疫，序贯免疫显著提升了豚鼠血清的中和强度和中和广谱度。因此，序贯免疫结合共性基因序列模拟临床患者自然感染过程的疫苗设计方式，可以成为一种诱导HIV广谱中和抗体的手段。
人类免疫缺陷病毒;广谱中和抗体;序贯免疫;共性基因序列;Env三聚体
吉林大学
博士
微生物学
高峰
2023
中文
R512.91
2023-08-23（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）