基于Feed-Batch模式优化rh-TPO的细胞培养及蛋白纯化方法的改进
背景：重组人血小板生成素（recombinanthumanthrombopoietin,rh-TPO）是332个氨基酸，经仓鼠卵巢细胞（Chinesehamsterovarycells,CHO）工程细胞表达的重组糖蛋白，通过与其特异性受体Mpl结合而调节巨核细胞的生长、分化、成熟并分裂形成有功能的血小板，用于治疗包括实体瘤及急性白血病放化疗后、骨髓移植、再障和其它骨髓功能不全及人类免疫缺陷病毒（humanimmunodeficiencyvirus,HIV）等造成的血小板严重减少和特发性血小板减少性紫癜（idiopathicthrombocytopenicpurpura,ITP）等的病症。但目前的方法过于复杂繁琐，培养基存在潜在动物源性病毒及水解蛋白，培养工艺复杂，目的蛋白表达量低，同时，蛋白纯化步骤多，潜在病毒未能灭活，且蛋白纯化使用的有机溶剂对职业健康存在潜在危害。因此亟需建立一种简单的、批量的、稳定的培养模式与高效的蛋白纯化方法提高产量，增加收率，同时解决潜在病毒未被灭活造成药物安全性及职业健康危害等问题的新工艺方法。 目的：建立一种新型的Feed-batch流加培养模式及蛋白纯化的方法。 方法：通过摇瓶实验进行不同厂家培养基的筛选，建立了化学成分定义清楚的培养基，采用Feed-batch培养模式在10L及100L反应器中发酵培养，建立高表达量的发酵关键参数，通过离子交换、疏水层析等蛋白纯化步骤，解决工艺复杂、产率低及潜在病毒未被灭活的rh-TPO的原液制备方法。 结果： 1.本工艺采用目前最为先进的不含动物源性、不含水解蛋白，化学成分明确的进口SigmaEX-CELLAdvancedTMCHO作为基础培养基，HyCloneTMCellBoostTM7a/7b作为流加培养基，替代了老式传统具有潜在病毒危害及成分复杂的培养基。 2.细胞培养实验结果显示用Sigma培养基对CHO-K1细胞进行复苏传代培养，16天之内培养体积可达到1200ml，活细胞密度不低于4.0×106个/ml，细胞活力不低于95%；以Sigma培养基为基础培养基，7a/7b培养基为流加培养基对CHO-K1细胞进行摇瓶培养，收获时目的蛋白表达量可达到90mg/L以上，符合实验要求。 3.三批10L反应器实验结果显示活细胞密度最高可达6.0×106个/ml，细胞活力维持在90%以上的培养时间都可以达到8-9天，目的蛋白表达量最高可以达到103mg/L。 4.三批100L规模细胞培养实验结果表明三批活细胞密度最高时均在3×106个/ml，细胞活力均在80%以上，蛋白表达量均在100mg/L以上。 5.采用系列层析填料的筛选，上样条件、洗脱条件的优化，最终确定了该Feed-batch模式下，蛋白纯化的方法第一步为MMCDiamond，上样条件为20mMPB0.1MNaCl，pH6.5±0.2，Cond：11~15ms/cm，清洗条件：1MNaClpH6.5，洗脱条件：50mMTrispH8.01MNH4Cl2MUrea。第二步为ButylHP，上样条件：20mMPB0.7M(NH4)2SO4pH7.0，清洗用20mMPB0.7M(NH4)2SO4pH7.0，洗脱采用10mMPB一步洗脱.。第三步为MixAMustang，最终确认上样条件为20mMTris0.1MNaClpH8.0，清洗条件：20%20mMTris1MNaClpH8.0清洗，洗脱条件：20mMTris1MNaClpH8.0一步洗脱。 6.病毒灭活实验结果表明该工艺不仅能够去除大量的内源及外源脂胞膜病毒，还可以去除无脂胞膜病毒，同时能够较高的保持蛋白活性，降低（Solvent/Detergent,S/D）灭活剂残留量。 7.药代动力学及药效学研究实验结果表明rh-TPO给药后无严重不良事件和严重不良反应，rh-TPO给药后，药物分布广泛，半衰期长，Tmax相对稳定，rh-TPO剂量增长与药物系统暴露量间存在良好的相关性（决定系数均大于0.9）；rh-TPO与特比澳的AUC0-t比值为105%，其消除半衰期之比为1.1，rh-TPO的Tmax中位数稳定在9-12h，且与特比澳的Tmax中位数12h具有可比性。 结论： 1.本工艺建立了化学成分定义清楚的培养基，替代了传统具有动物源性及植物源性水解蛋白的潜在外源病毒的复杂培养基。 2.本工艺建立了Feed-batch流加培养模式，通过摇瓶逐级放大到100L的批次培养，优化提升了细胞的生长密度，提高了蛋白的表达；依据蛋白属性建立了简单高效的阳离子交换、疏水层析及阴离子交换层析方法，替代了异丙醇及乙腈反向层析、羟基磷灰石的复杂纯化工艺，蛋白纯化收率明显提高，成功建立了一种全新的重组人血小板生长因子的Feed-batch细胞培养及蛋白纯化方法。 3.本工艺通过灭活剂的选择，纳滤膜的优化建立了去除及灭活大量内源及外源脂胞膜、无脂胞膜病毒的措施，与同类已上市产品相比具有明显的安全性优势。 4.本工艺在纯化步骤中去除了异丙醇及乙腈的反向层析法，减少了职业健康的危害及保障了安全环保。 5.该工艺提纯的rh-TPO在体内具有良好的安全性及升血小板作用，为后续临床实验的开发打下坚实的基础。
重组人血小板生成素;流加培养;病毒灭活;蛋白纯化;离子交换;血小板减少
吉林大学
硕士
药理学
康劲松
2023
中文
Q813.11;R915
2023-08-23（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）