NAC通过SIRT1/NF-κB/Caspase-1通路减轻牙周膜细胞焦亡和成骨分化损伤的机制研究
目的：牙周炎是一种慢性炎症性疾病，牙周炎的发病和进展的特点是大量活性氧（reactiveoxygenspecies，ROS）的产生。由过量的ROS引起的细胞焦亡是一种新型的程序性细胞死亡，其会使细胞膜发生破裂并使细胞内的炎性因子释放出来，增加了炎症反应和骨吸收。而N-乙酰半胱氨酸（N-acetylcysteine，NAC）是一种抗氧化剂，它可以清除过量产生的ROS并抑制细胞发生凋亡，但它在细胞焦亡以及成骨分化中的作用和其机制还不明确，需要更多的研究来探索。细胞受到刺激后，核因子-κB（thenuclearfactor-κB，NF-κB）转录进入到细胞核后可以激活核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3（NOD-likereceptorpyrindomain-containingprotein3，NLRP3）炎性小体，进而活化半胱天冬酶-1（Caspase-1），是细胞焦亡发生的经典途径。沉默信息调节器2同源物1（Silentinformationregulator2homolog1，SIRT1）是一种去乙酰化酶，其可使一些蛋白去乙酰化而发挥抗炎抗氧化的作用，而SIRT1的活性能够被过量产生的ROS所抑制。因此，本研究旨在探讨NAC能否通过清除过量的ROS来恢复SIRT1的表达，进而调控NF-κB/Caspase-1信号通路，最终减轻人牙周膜细胞（humanperiodontalligamentcells，hPDLCs）焦亡和成骨分化损伤。 方法：第一部分：观察NAC对脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）/三磷酸腺苷（adenosinetriphosphate，ATP）诱导的hPDLCs焦亡和成骨分化的影响。从人牙周膜组织中分离出hPDLCs并进行细胞鉴定，将细胞分为三组：对照组、LPS/ATP组、LPS/ATP+NAC组，首先采用CCK-8法筛选NAC药物浓度用于后续实验；荧光显微镜用来观测细胞中ROS产生情况；流式细胞仪定量检测细胞中ROS的产生量以及焦亡的发生率；碱性磷酸酶（alkalinephosphatase，ALP）以及茜素红染色观察细胞成骨分化情况。 第二部分：NAC减轻hPDLCs焦亡和成骨分化损伤的机制研究。将细胞分为七组：对照组、LPS/ATP组、LPS/ATP+NAC组、LPS/ATP+NAC+EX-527（SIRT1抑制剂）组、LPS/ATP+SRT1720（SIRT1激活剂）组、LPS/ATP+BAY-11-7082（NF-κB抑制剂）组以及LPS/ATP+VX-765（Caspase-1抑制剂）组。流式细胞仪检测细胞焦亡的发生率；ALP以及茜素红染色观察细胞成骨分化情况；qRT-PCR用来检测通路相关基因（SIRT1、NF-κBp65、ASC、NLRP3和Caspase-1）以及成骨相关基因（ALP、OCN和RUNX-2）的表达；WesternBlot检测通路相关蛋白（SIRT1、NF-κBp65、乙酰化NF-κBp65、ASC、NLRP3、Caspase-1和GSDMD-N）以及成骨相关蛋白的表达，ELISA检测白介素-18（interleukin-18，IL-18）、白介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）以及乳酸脱氢酶（lactatedehydrogenase，LDH）表达。 结果：第一部分：筛选出无细胞毒性且能够减轻hPDLCs损伤的NAC浓度为10mM；与对照组相比，在LPS/ATP刺激下，hPDLCs中ROS水平以及细胞焦亡率增加，同时，从ALP和茜素红染色结果可以看出，hPDLCs成骨分化能力显著下降。而在LPS/ATP+NAC组中，与LPS/ATP组相比，hPDLCs中ROS水平及焦亡的发生率显著降低，成骨分化能力提高。 第二部分：与对照组相比，LPS/ATP刺激使细胞焦亡率增加，成骨分化功能降低，qRT-PCR及WesternBlot结果表明LPS/ATP刺激降低了SIRT1、ALP、OCN和RUNX-2的表达，增加了NF-κBp65、乙酰化NF-κBp65、ASC、NLRP3、Caspase-1和GSDMD-N的表达，同时，ELISA结果表明LPS/ATP刺激增加了IL-18、IL-1β和LDH的表达。而与LPS/ATP组相比，LPS/ATP+NAC组和LPS/ATP+SRT1720组细胞焦亡率降低，成骨分化功能提高，并增加了SIRT1、ALP、OCN和RUNX-2的表达，降低了NF-κBp65、乙酰化NF-κBp65、ASC、NLRP3、Caspase-1和GSDMD-N的表达，减少了IL-18、IL-1β和LDH的表达。与LPS/ATP+NAC组相比，LPS/ATP+NAC+EX-527组细胞焦亡率增加，成骨分化功能降低，并降低了SIRT1、ALP、OCN和RUNX-2的表达，增加了NF-κBp65、乙酰化NF-κBp65、ASC、NLRP3、Caspase-1和GSDMD-N的表达，同时增加了IL-18、IL-1β和LDH的表达。与LPS/ATP组相比，LPS/ATP+BAY-11-7082组细胞焦亡率降低，成骨分化功能提高，ALP、OCN和RUNX-2的表达量升高，SIRT1的表达量无明显变化，而NF-κBp65、乙酰化NF-κBp65、ASC、NLRP3、Caspase-1和GSDMD-N的表达量显著下降，IL-18、IL-1β和LDH的表达量降低。与LPS/ATP组相比，LPS/ATP+VX-765组细胞焦亡率降低，成骨分化功能提高，ALP、OCN和RUNX-2的表达量升高，SIRT1、NF-κBp65、乙酰化NF-κBp65、ASC和NLRP3的表达量无明显变化，Caspase-1和GSDMD-N的表达量显著下降，IL-18、IL-1β和LDH的表达量降低。 结论：NAC可通过调节SIRT1/NF-κB/Caspase-1信号轴来抑制LPS/ATP诱导的hPDLCs焦亡和成骨分化损伤，为NAC在牙周炎中的应用提供了理论基础。
N-乙酰半胱氨酸;牙周膜细胞;SIRT1;Caspase-1;牙周炎;成骨分化
西南医科大学
硕士
口腔临床医学
郭玲
2023
中文
R781.4
2023-08-22（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）