氯化钴预处理rBMMSCs复合CS支架对体内外成骨性能的实验研究
目的：探讨低氧模拟剂（CoCl2）预处理大鼠骨髓间充质干细胞（rBMMSCs）并于胶原蛋白海绵支架（CS）共培养的可行性，并将成为未来骨再生和其他组织工程应用的治疗工具。方法：分离培养rBMMSCs，使用流式细胞术鉴定表面标记的表达物CD90和CD45，使用成品成骨和成脂分化培养基诱导多谱系分化。设置6个不同浓度的CoCl2梯度组（0,50,100,200,300,400μmol/L）与rBMMSCs共培养，MTT法检测细胞生长状态以确定最佳CoCl2浓度。将最佳浓度的CoCl2与空白对照组进行Transwell与划痕实验进行细胞迁移能力检测，茜素红、碱性磷酸酶与RT-PCR检测相关特异成骨因子和对HIF-1α的影响。细胞与CS支架体外共培养，扫描电子显微镜与CCK-8法进一步评估共培养细胞附着于支架材料上的形态学变化与增殖能力。随后建立了体内大鼠股骨损伤模型，分为3组，即实验组：CoCl2+rBMMSCs+CS支架；对照组：rBMMSCs+CS支架；空白组：CS支架。在术后8w，大体观察、X线片、MicroCT、组织学染色与免疫组化验证CoCl2对rBMMSCs对骨缺损部位愈合的影响。结果：①流式细胞术鉴定结果显示CD90在细胞中呈94.5％高表达，而CD45呈0.3%低表达，验证了分离的rBMMSCs符合国际细胞治疗学会描述的标准；②成骨与成脂培养基分别诱导，染色后显示出丰富的钙结节与脂滴，表明从骨髓中分离的第3代rBMMSCs具有成骨和成脂肪分化能力；③CCK-8细胞增殖实验显示，100μmol/L的CoCl2能显著促进rBMMSCs的增殖（P＜0.001），将此浓度作为实验组；④Transwell与划痕实验结果显示，实验组与空白对照组相比，能显著促进细胞的迁移，促进损伤区域的细胞愈合（P＜0.001）；⑤茜素红、碱性磷酸酶染色结果显示，实验组随着成骨诱导时间的增加，显示出更多的钙化结节，表明有更强大的成骨能力（P＜0.001）；⑥RT-PCR结果显示，实验组促进了成骨细胞标记基因(COL-Ⅰ、BMP-2、RUNX2、ALP)与HIF-1α的表达（P＜0.001）；⑦扫描电子显微镜与CCK-8法结果显示,细胞支架上的伸出伪足，在材料的孔隙表面爬行，并且随着培养天数的增加，吸光度增加，表明细胞在支架上可充分增殖（P＜0.05）；⑧动物体内实验研究表明，使用CoCl2、rBMMSCs与CS结合可以促进骨缺损部位再生，加速大鼠股骨截断部位的骨愈合。结论：①适宜浓度的CoCl2体外能显著促进rBMMSCs的增殖与迁移能力，并且能够促进成骨与抑制HIF-1α的降解；②适宜浓度的CoCl2体内与种子细胞、支架共培养在大鼠股骨缺损部位能显著促进成骨分化与骨愈合。
胶原蛋白海绵支架;氯化钴预处理;低氧模拟剂;骨髓间充质干细胞;成骨性能
新疆医科大学
硕士
口腔临床医学
何惠宇
2023
中文
R318.08
2023-08-22（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）