黑曲霉还原Cr(VI)关键因子的挖掘鉴定与应用
在镀铬、染料和皮革等行业排出的废物里含有大量重金属，导致环境被污染，生物的生命安全受到危害。为了修复环境中铬污染，将具有强氧化性及生物可利用性的Cr(Ⅵ)还原为低毒且低溶解性的Cr(Ⅲ)，成为许多研究者关注的方向。虽然已有报道黑曲霉具有还原Cr(Ⅵ)的能力，但具体的分子机制还尚不明确。 在本研究中，前期实验结果表明黑曲霉S469可耐受100mg/L的Cr(Ⅵ)，并且在其细胞质中可能存在可溶性铬酸盐还原酶。为研究黑曲霉还原Cr(Ⅵ)的分子机理，增强其Cr(Ⅵ)还原能力，本研究通过生物信息学工具检索得到黑曲霉中与铬酸盐还原酶、可转运Cr(Ⅵ)的硫酸盐转运蛋白和超氧化物歧化酶的相关基因，并对它们进行了功能鉴定。最终确定了黑曲霉中铬酸盐还原酶ChrA、硫酸盐转运蛋白SulB和超氧化物歧化酶SodA在Cr(Ⅵ)还原过程中的功能。随后，通过过表达chrA、sulB和sodA增强了黑曲霉的Cr(Ⅵ)修复能力，也进一步证实了这些基因的功能。本研究主要结果如下。 （1）为鉴定黑曲霉中的铬酸盐还原酶，通过来自Escherichiacoli铬酸盐还原酶YieF和Aspergillusniger假定铬酸盐还原酶（XP_001388504.1）的序列在黑曲霉ATCC1015中比对分析，得到两个疑似铬酸盐还原酶基因chrA和chrB；利用分子生物学技术和发酵工艺进行相关基因的功能鉴定，结果表明，在Cr(Ⅵ)的胁迫下，S469中chrA的表达量上调177.9倍；在S469中分别对疑似基因进行敲除，发现chrA敲除菌较chrB敲除菌的Cr(Ⅵ)还原效率明显更低（P＜0.001）。在S469中对疑似基因分别进行过表达后，发现chrA过表达菌株还原Cr(Ⅵ)能力有更为显著的提升，还原效率可达42.9％。综上所述，ChrA为黑曲霉中一种铬酸盐还原酶。 （2）硫酸转运蛋白可将主要以CrO42-形式存在的Cr(Ⅵ)转运至胞内，为鉴定黑曲霉中的硫酸转运蛋白，对来自酿酒酵母的硫酸转运蛋白Sul1p和Sul2p进行序列比对和功能域分析，初步确定黑曲霉中负责硫酸转运的假定蛋白SulA和SulB；通过分析sulA和sulB在Cr(Ⅵ)诱导下的相对表达量和敲除菌株还原Cr(Ⅵ)的效率，发现SulB为主要介导黑曲霉对Cr(Ⅵ)吸收的硫酸转运蛋白。利用基因工程技术在过表达chrA的菌株上过表达sulB，使Cr(Ⅵ)还原效率进一步提高了23.5％。综上所述，SulB是黑曲霉的硫酸转运蛋白，且结果表明加强Cr(Ⅵ)的转运可进一步增强黑曲霉对Cr(Ⅵ)的还原能力。 （3）黑曲霉中，伴随着Cr(Ⅵ)还原所产生的ROS会使菌体产生氧化应激，为降低ROS引起的氧化损伤，本研究还对黑曲霉中的超氧化物歧化酶进行了功能鉴定。通过数据库检索得到黑曲霉中的超氧化物歧化酶SodA、SodB和SodC，将编码这些酶的基因分别继续在黑曲霉中表达，分析不同改造菌株的Cr(Ⅵ)还原能力，结果表明SodA对ROS的清除起主要作用，过表达sodA可进一步增强黑曲霉的Cr(Ⅵ)还原能力。
污水处理;六价铬;三价铬;黑曲霉;铬酸盐还原酶;硫酸转运蛋白
天津科技大学
硕士
轻工技术与工程
刘浩
2022
中文
TQ925;X703
2023-08-29（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）